转基因食品安全分析课程第二部分转基因食品生物技术

第二章

转基因食品生物技术当前第1页\共有186页\编于星期四\13点何为生物技术？当前第2页\共有186页\编于星期四\13点

人类在1万年前就开始用牲畜耕种、饲养家畜，提供稳定的粮食和肉类。6千年前利用发酵、酿造技术生产酒类、面包。——均属生物技术！当前第3页\共有186页\编于星期四\13点远古人类发现，吃剩的米粥数日后变成了醇香可口的饮料—人类最早发明的酒丰富多彩的远古酒文化微生物发酵当前第4页\共有186页\编于星期四\13点我国古代的酿酒作坊（四川新都县出土的汉代画像）当前第5页\共有186页\编于星期四\13点↑公元前2300年左右，埃及人酿制啤酒的场面（某金字塔壁画）丰富多彩的酒文化当前第6页\共有186页\编于星期四\13点(EdwardJenner,1749~1823)首创用牛痘预防天花，是免疫学的发展，开创了生物技术的先河。当前第7页\共有186页\编于星期四\13点

1676年荷兰人A.Leeuwenhoek用自磨镜片，创造了一架原始显微镜，生物工程进入微观形态学发展阶段。当前第8页\共有186页\编于星期四\13点一、传统生物技术

生物技术的发展与食品发展的历史是密不可分的，对促进人类社会的文明发展有着非常重要的意义，其发展简史如下：BC6000年，古埃及人和古巴比仑人利用微生物发酵生产酒精；我国也在石器时代后期，开始利用谷物酿酒；

BC4000年，古埃及人开始用酵母菌发酵生产面包；

BC221年，周代后期我国人民开始制作豆腐、酱油和醋生物技术的形成和发展当前第9页\共有186页\编于星期四\13点1865年当时属奥地利的布隆（Brunn）基督教修道院的修士格里高·孟德尔（GregorJohannMendel），根据他8年植物杂交实验的结果，2月8日在当地的科学协会上宣读了一篇题为“植物杂交实验”的论文，1866年正式发表在该协会的会刊上。但这一伟大的发现被搁置了35年，孟德尔临终前说：“等着瞧吧，我的时代总有一天要来临”当前第10页\共有186页\编于星期四\13点当前第11页\共有186页\编于星期四\13点

1885年，巴斯德（LouisPasteur)首先证实发酵是由微生物引起的，并建立了微生物纯种培养技术；

20世纪20年代，工业生产中大规模采用纯种培养技术发酵生产丙酮和丁醇；同时代，AlexanderFleming爵士发现了青霉菌可以产生青霉素，50年代青霉素大量生产，为人类疾病治疗做出了巨大贡献，同时带动了发酵工业和酶制剂工业的发展；以上属于传统传统意义上的生物技术，也是近代生物技术的建立和全盛时期。当前第12页\共有186页\编于星期四\13点细菌的发现我们已经知道,单个的细菌是十分微小的,它们的奥秘是怎样被发现的?细菌的发现者是谁?他为什么能发现细菌?当前第13页\共有186页\编于星期四\13点细菌的发现者是谁?17世纪的荷兰人列文虎克并非职业科学家，但是他十分热衷自己制造显微镜经过几年的努力，他制造了能放大300倍的显微镜，是世界先进水平当前第14页\共有186页\编于星期四\13点列文·虎克用自制的显微镜观察酵母菌、人的精液、雨水中的微生物等，发现了一个新的世界他为什么能发现细菌?当前第15页\共有186页\编于星期四\13点他是怎样让世人知道他的发现的?列文·虎克把自己的发现仔细记录下来他把观察结果寄给了当时的权威科学机构——英国皇家学会，从此名扬天下，被誉为细菌学的开创者当前第16页\共有186页\编于星期四\13点他的成功是偶然的吗？他善于发现和提出问题:微小的世界是怎样的?制定实施实验计划:自制显微镜,坚持观察各种微小物体60年,做详细记录善于表达和交流:把观察结果寄给英国皇家学会他的做法就是一个标准的科学探究过程他还发现了毛细血管、人类的精子、多种原生动物，成功绝非偶然遗憾：微生物从哪来？当前第17页\共有186页\编于星期四\13点微生物学之父：法国人路易斯·巴斯德巴斯德以严谨的科学精神向世人揭示了细菌的许多秘密。例如，细菌不会在自然界凭空出现当前第18页\共有186页\编于星期四\13点著名的巴斯德鹅颈瓶实验让认为细菌是自然产生的人彻底闭嘴鹅颈瓶实验的启示：1细菌可以用高温杀灭；2经杀菌的食物不接触细菌就不会腐败当前第19页\共有186页\编于星期四\13点鹅颈瓶实验原理的应用1、外科手术用具的消毒，挽救了许多病人的生命当前第20页\共有186页\编于星期四\13点鹅颈瓶实验原理的应用2、巴氏消毒法，这种灭菌法由巴斯德发明,因此得名。牛奶、啤酒和葡萄酒、罐头等，加热到70～80℃维持5～30分钟，就能消灭绝大部分细菌，但不会影响味道和营养。当前第21页\共有186页\编于星期四\13点二、现代生物技术

R.Franklin&Wilkins在1952年底拍得了DNA的X-射线衍射照片当前第22页\共有186页\编于星期四\13点1953年，沃森（）和克里克（）提出DNA分子是双螺旋结构（doublehelix），奠定了现代分子生物学研究的基础。当前第23页\共有186页\编于星期四\13点

1962年，Wilkins、Watson和Crick获的诺贝尔医学和生理学奖当前第24页\共有186页\编于星期四\13点1965年，法国科学家Jacob和Monod提出了著名的乳糖操纵子学说，开创了基因表达调控研究的先河；

1968年，Holly阐明了酵母丙氨酸tRNA的核苷酸序列，Khorana首次合成核酸分子，并且人工复制了酵母基因；从而分享了诺贝尔医学和生理学奖。FigureThelacoperonincludesthreegenes

当前第25页\共有186页\编于星期四\13点MarshallW.Nirenberg

RobertW.Holley

HarGobindKhorana

CornellUniversity

Ithaca,NY,USAUniversityofWisconsin

Madison,WI,USANationalInstitutesofHealth

Bethesda,MD,USA1/3oftheprize

1/3oftheprize

1/3oftheprize当前第26页\共有186页\编于星期四\13点20世纪60年代末，斯坦福大学的生物化学教授PaulBerg开始研究猴病毒SV40，于1972年获得了世界第一例重组DNA，1980获得诺贝尔化学奖；——生物技术时代的新纪元PaulBerg

WalterGilbert

FrederickSanger

1/2oftheprize1/4oftheprize1/4oftheprize当前第27页\共有186页\编于星期四\13点1972年，美国加州大学的Boyer教授从大肠杆菌中分离出一种新的核酸酶EcoRⅠ，它可以特异性地切割DNA，这种新的核酸酶就是一种限制性内切酶——生物学家有了强大的生物刀。

随后，陆续发现了近百种内切酶，可以更加自如地对DNA进行操作。Boyer教授成为美国第一家上市生物公司Genentech的副总裁。HerbertBoyer

当前第28页\共有186页\编于星期四\13点1977年，美国科学家Sanger设计出了一种DNA测序的方法，即双脱氧末端链终止法；同年，Maxam和Gilberg也发明了一种化学测序方法——两种方法为DNA序列分析提供了有力工具，极大地推动了分子生物学的研究。FrederickSanger

WalterGilbert

1980年获得了诺贝尔医学和生理学奖当前第29页\共有186页\编于星期四\13点1984年，德国人Kohler、美国人Milstein和丹麦人Jerne由于发展了单克隆抗体技术，完善了极微量蛋白质的检测技术而分享了诺贝尔医学和生理学奖。NielsK.Jerne

CésarMilstein

GeorgesJ.F.Köhler

1/3oftheprize1/3oftheprize1/3oftheprize当前第30页\共有186页\编于星期四\13点1985年，美国科学家Mullis发明了聚合酶链式反应技术（PolymeraseChainReaction,PCR），为分子检测、基因突变、基因工程提供了有力的工具，因此，1993年获得诺贝尔化学奖。forhisinventionofthepolymerasechainreaction(PCR)method

KaryB.Mullis

1/2oftheprize

当前第31页\共有186页\编于星期四\13点

当然，以上内容只是促进生物技术发展的几个重要研究成果和里程碑！其实，还有许多重要的研究成果：如，1928年格里菲斯（FrederickGriffith）的细菌转化实验；Avery的离体转化实验等证明DNA是遗传物质当前第32页\共有186页\编于星期四\13点Meselson和Stahl关于DNA的半保留复制等为现代基因工程技术奠定了坚实的基础。与此同时，细胞培养技术、细胞融合技术、现代发酵工程、现代酶工程、生物工程下游技术和现代分子检测技术等也取得了长足的发展。当前第33页\共有186页\编于星期四\13点基因工程技术转基因植物转基因动物主要内容GMFood

–生物技术当前第34页\共有186页\编于星期四\13点怎样制造出转基因食品？怎样获得转基因生产原料？转基因食品GMFood

–生物技术生物技术基因工程的原理是什么？什么是基因工程？当前第35页\共有186页\编于星期四\13点豆科植物的根瘤能够固定空气中的氮资料一：目前，全球的氮肥生产耗费世界总电力的3%-4%，但农作物只能吸收氮肥的1/10，造成了大面积土壤和水质的污染。资料分析引入GMFood

–生物技术当前第36页\共有186页\编于星期四\13点蜘蛛能够吐出蛛丝资料二：蛛丝是自然界最奇特的物质之一，其韧度是同样直径钢材的好几倍。但蜘蛛不能家养，因为它们会互相吞食，所以不可能建立人工饲养蜘蛛的农场。30多年来，科学家们一直试图找到利用其他生物体来制造蛛丝的办法。GMFood

–生物技术当前第37页\共有186页\编于星期四\13点

资料三：以往，治疗糖尿病的胰岛素是从动物胰腺中提取的，从100千克猪、牛等动物的胰腺只能提取3－4克胰岛素，治疗一个患者需宰杀40－50头牛，这种药物的造价昂贵。

微生物可以有分泌产物，且微生物繁殖速率快GMFood

–生物技术当前第38页\共有186页\编于星期四\13点设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让易繁殖易生长的微生物“吐出”蛛丝？设想二能否让微生物产生出胰岛素、干扰素等珍贵的药物？设想三经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术——基因工程。GMFood

–生物技术当前第39页\共有186页\编于星期四\13点基因工程：按照预定设计，在体外对不同来源DNA分子进行人工切割、连接，插入载体DNA分子，使遗传物质重新组合、改造，经转移、导入到受体细胞，使之持续稳定繁殖、目的基因扩增、表达，获得所需产品的工程。GMFood

–生物技术第一节基因工程技术一、基因工程的定义通俗的说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状（从而获得新生物、新产品）。当前第40页\共有186页\编于星期四\13点外源DNA（需经剪接、重组才能获得目的基因）GMFood

–生物技术载体DNA分子重组基因（目的基因+载体基因）受体细胞在受体内扩增、表达表达产物的分离获得新性状生物基因工程基本流程图获得表达产物当前第41页\共有186页\编于星期四\13点基本原理：操作水平：目的：基因重组DNA分子水平定向地改造生物的遗传性状，获得人类所需要的新物种或产品。GMFood

–生物技术基本元件：供体、载体和受体上游技术：基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）。下游技术：基因工程菌（细胞）的大规模培养、外源基因表达产物的分离纯化过程。DNA重组技术基因拼接技术当前第42页\共有186页\编于星期四\13点对基因工程原理的学习，其实质就是要求了解/理解/掌握基因工程操作过程中所涉及的步骤及运用的技术。GMFood

–生物技术二、基因工程的原理当前第43页\共有186页\编于星期四\13点GMFood

–生物技术基因工程的主要操作步骤获得目的基因与选择载体1将目的基因与载体结合2将目的基因导入受体细胞3目的基因的表达和检测4有了目的基因，才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可进行遗传、表达和发挥作用。

表达载体进入受体细胞稳定表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。才能确定目的基因是否真正在受体细胞中稳定遗传和正确表达。当前第44页\共有186页\编于星期四\13点

SS基因基因载体重组体分切接转筛表SSGMFood

–生物技术当前第45页\共有186页\编于星期四\13点分子水平操作阶段

——获得含目的基因的重组体分子

第一环节

分离：提取、分离含目的基因的DNA分子和载体DNA分子，在分离提取过程中，注意质、量，减少损伤。

第二环节

切割：选择合适的RE工具酶，分别对外源目的DNA分子和载体DNA分子进行酶解切割。

第三环节

连接：用DNA连接酶，将目的基因与载体在体外连接为一个重组DNA分子，并进行鉴定。GMFood

–生物技术当前第46页\共有186页\编于星期四\13点细胞水平操作阶段

——把含目的基因的重组体导入受体细菌或受体细胞，赋予其“生命”让其表达，获得产品。

第一环节

转移：利用DNA转移技术，把构建的重组体导入到受体菌或受体细胞中，获得工程菌或工程细胞。

第二环节

筛选：利用核酸杂交，酶切分析、PCR和表型特征等技术，筛选出已克隆化的工程菌/细胞。

第三环节

表达：大量培养含重组体的工程菌/细胞，诱导其表达，并对表达产物进行鉴定，提取和纯化。GMFood

–生物技术当前第47页\共有186页\编于星期四\13点目的基因的分离获取是基因工程研究中最主要的要素，目的基因的成功分离是基因工程操作的关键。

由于每种基因，特别是单拷贝基因占整个生物基因组很小部分，且DNA的化学结构相似，都是由A、T、G、C四种碱基组成，具有极相似的理化性质，这给分离特定的目的基因带来很大困难。1目的基因的获取GMFood

–生物技术当前第48页\共有186页\编于星期四\13点基因分离的物理化学方法鸟枪法分离基因cDNA文库的建立与基因的分离直接从特定的mRNA分离基因基因组文库的建立和基因的分离从蛋白质入手分离编码此蛋白的基因基因的化学合成利用PCR或PT-PCR扩增分离基因GMFood

–生物技术1.1获取目的基因的方法当前第49页\共有186页\编于星期四\13点GMFood

–生物技术生物材料DNA目的基因的获取mRNAcDNAPCR反转录cDNA文库DNA一定大小范围的DNA基因组文库人工合成限制酶切当前第50页\共有186页\编于星期四\13点基因分离的物理化学方法根据DNA分子的两条链存在着G≡C、A＝T碱基配对。当DNA分子中某段的G≡C碱基对含量高，则其热稳定性就高，其熔解温度（Tm）值就高。因此可以通过控制熔解温度使富含A＝T区解链变性，而富含G≡C区仍维持双链，再利用单链核酸酶S1酶去除解开的单链部分，得到富G≡C区的DNA片段。例如海胆rDNA基因的分离。这是基因工程在初始阶段所用的方法，目前已不用。GMFood

–生物技术当前第51页\共有186页\编于星期四\13点鸟枪法分离基因用限制性内切酶将基因组DNA进行切割，得到很多在长度上和一般基因大小相当的DNA片段〔相对分子质量（0.8～9）×106〕。将这些片段混合物随机地重组入适当的载体,转化后在受体菌中进行扩散，再用适当的方法筛选出你所要的基因。筛选方法要简单，如利用特定基因缺陷型（如营养缺陷型等）的受体菌，或特定的寡核苷酸或DNA片段探针以及特定基因产物的抗体，可通过对表型的筛选或用分子杂交技术、免疫筛选技术检出你所要的基因。GMFood

–生物技术当前第52页\共有186页\编于星期四\13点cDNA文库的建立与基因的分离cDNA是指与mRNA序列互补的DNA序列。cDNA文库最关键的特征是，它只包括在特定的组织或细胞类型中已经被转录成mRNA那些基因序列。由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定状态是由特定基因的表达所决定的，因此各自的mRNA种类就不同，由此而产生独特的cDNA文库。在建立cDNA文库时，如果选择的细胞或组织类型得当，就容易从cDNA文库中筛选出所需要的基因序列。GMFood

–生物技术当前第53页\共有186页\编于星期四\13点cDNA文库建立的步骤分离表达目的基因的组织或细胞从组织或细胞中制备总体RNA或mRNAcDNA的甲基化和接头的加入双链cDNA同载体的连接第二条cDNA链的合成第一条cDNA链的合成12345GMFood

–生物技术当前第54页\共有186页\编于星期四\13点直接从特定的mRNA分离基因如果细胞中特定mRNA含量非常高，如哺乳动物的网织红血细胞中，珠蛋白mRNA的比例占总mRNA量的90%以上，这样就可以通过mRNAcDNAdscDNA（双链cDNA）的途径而绕过建立cDNA文库这一步，直接得到基因。GMFood

–生物技术当前第55页\共有186页\编于星期四\13点基因组文库的建立和基因的分离基因组文库：是指将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后，所产生的基因组DNA片段随机地同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列。基因组DNA文库的用途：分析、分离特定的基因片段；通过染色体步查研究基因的组织结构；用于基因表达调控研究；用于人类及动、植物基因组工程的研究等。从真核基因组DNA所分离得到的基因序列包含有内含子序列，因此不能直接在原核细胞中进行表达。GMFood

–生物技术当前第56页\共有186页\编于星期四\13点从蛋白质入手分离基因如果有足够量可产生抗体的来源于真核细胞的蛋白质，可以通过双抗体免疫法分离出此蛋白质的基因。基本原理：核糖体沿mRNA进行多肽链合成时形成多聚核糖体蛋白，而具有不同长度的新生肽链在核糖体上不断延伸。把从细胞匀浆液制备的多聚核糖体蛋白同特定抗体一起保温，形成二者的复合体，然而这种复合体不足以从细胞总多聚核蛋白体中沉淀出来。GMFood

–生物技术当前第57页\共有186页\编于星期四\13点基因的化学合成基因片段的全化学合成首先合成组成一个基因的所有片段，相邻的片段间有4～6个碱基的重叠互补，在适当条件下（主要是温度条件）经退火后，再用T4DNA连接酶将各片段以磷酸二酯键的形式连接成一个完整的基因。因化学合成的基因在纯化后其5′和3′端都为羟基，所以在组建基因之前要将DNA片段的5′端磷酸化。GMFood

–生物技术当前第58页\共有186页\编于星期四\13点基因的化学合成及克隆图解3′5′5′3′5′3′退火DNA连接酶T4DNA连接酶退火合成的DNA全基因EcoRⅠBamHⅠAmpTetAmpBamHⅠEcoRⅠBamHⅠBamHⅠEcoRⅠEcoRⅠ合成的基因转化AmprTetrAmprTetsGMFood

–生物技术当前第59页\共有186页\编于星期四\13点基因的化学—酶促合成不需要组成完整基因的所有寡核苷酸片段，而是合成其中一些片段，相邻的3′末端有一短的顺序相互补，在适当条件下通过退火形成模板-引物复合体，然后在存在四种dNTP的条件下，用E.coli的DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）去填补互补片段之间的缺口，最后用T4DNA连接酶连接，再用适当的限制性内切酶切割后重组入载体。GMFood

–生物技术当前第60页\共有186页\编于星期四\13点基因的化学-酶促合成图解分子克隆磷酸化退火DNA聚合酶ⅠKlenow片段dNTPs连接酶GMFood

–生物技术当前第61页\共有186页\编于星期四\13点利用PCR或RT-PCR分离基因主要用于基因的分离和改造。特别是对原核基因的分离，只要知道基因的核苷酸序列，就可以设计适当的引物从染色体DNA上将所要的基因扩增出来。反转-PCR（RT-PCR）是指从mRNA入手，通过反转录得到cDNA，在适当的引物存在下，再通过PCR将基因扩增出来。GMFood

–生物技术当前第62页\共有186页\编于星期四\13点GMFood

–生物技术1.2重要工具酶

限制性内切酶──基因的“剪刀”

限制性核酸内切酶(restrictionendonuclease,RE)是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。限制酶有三类（Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型），在DNA重组中使用的主要是Ⅱ型限制酶。当前第63页\共有186页\编于星期四\13点限制性内切酶的作用过程点击播放GMFood

–生物技术当前第64页\共有186页\编于星期四\13点基因的针线──DNA连接酶GMFood

–生物技术DNA连接酶（DNAligase）是通过催化两段或数段DNA片段的5′磷酸基与3′羟基之间形成磷酸二酯键而将其拼接起来的酶。常用的DNA连接酶是T4DNA连接酶。当前第65页\共有186页\编于星期四\13点DNA连接酶的作用过程点击播放GMFood

–生物技术连接酶的作用过程当前第66页\共有186页\编于星期四\13点DNA连接酶拼接

G

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GGC

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G用同种限制酶切割DNA连接酶连接的是DNA骨架上的缺口，不是碱基间的氢键GMFood

–生物技术当前第67页\共有186页\编于星期四\13点GMFood

–生物技术1.2基因的运输工具——载体要使外源DNA片段能在宿主细胞内复制、表达，必须有特殊的“载体”。具有一个或多个限制酶的酶切位点，以便于与外源目的基因片段连接，形成重组子。形成重组子后的运载体进入受体细胞后能稳定存在并进行复制、表达。载体DNA应具有能够观察的表型特征，便于目的基因在受体细胞内扩增后的筛选。在原核生物的DNA重组中常用的载体是质粒与噬菌体。酵母和动物病毒等常用作真核生物克隆的载体。当前第68页\共有186页\编于星期四\13点

质粒标记基因，便于进行检测。质粒存在于许多细菌和酵母菌等生物中,是细胞染色体外能够自主复制的很小的双链环状DNA分子。

GMFood

–生物技术质粒通过“转化”进入受体细胞内细胞吸收外来DNA而获得可遗传性状的过程当前第69页\共有186页\编于星期四\13点重要的大肠杆菌质粒载体pBR322载体特征：松弛型复制；拷贝数50～100/cell；有多个单一限制性核酸内切酶位点；许多酶切位点位于抗性基因内部，插入外源基因都会使抗性基因失活；用于基因克隆。GMFood

–生物技术当前第70页\共有186页\编于星期四\13点pUC质粒载体载体特征：(1)来自pBR322质粒的复制起点(ori)；(2)氨卞青霉素抗性基因(Ampr)；(3)大肠杆菌β-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端α-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ′基因；(4)多克隆位点(MCS)区段。GMFood

–生物技术当前第71页\共有186页\编于星期四\13点

噬菌体噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒的总称。GMFood

–生物技术噬菌体通过“侵染”将携带的重组DNA分子“注入”受体细胞内当前第72页\共有186页\编于星期四\13点重要的λ噬菌体基因组结构GMFood

–生物技术载体特征：(1)λ噬菌体颗粒中的DNA是线性环状的，约1/3是溶菌生长非必需的，可用外来DNA替换；(2)可以通过“体外包装”，形成携带有重组DNA分子的新噬菌体颗粒；(3)λ噬菌体侵染受体细胞后，可以在宿主细胞内增殖。“溶菌途径”或“溶源途径”当前第73页\共有186页\编于星期四\13点GMFood

–生物技术当前第74页\共有186页\编于星期四\13点

动物病毒质粒和噬菌体虽然是很好的基因载体，但只适用于原核生物。GMFood

–生物技术某些真核生物病毒能在寄主染色体上整合，可用作真核细胞DNA克隆的载体。反转录病毒和腺病毒已经被改造成能把外源DNA导入哺乳动物细胞的“病毒载体”。当前第75页\共有186页\编于星期四\13点

农杆菌（Ti质粒）GMFood

–生物技术农杆菌是生活在植物根的表面依靠由根组织渗透出来的营养物质生存的一类普遍存在于土壤中的革兰氏阴性细菌。根癌农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将其Ti质粒上的一段T-DNA插入到植物基因组中。将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物的转移和整合，然后通过细胞和组织培养技术，得到转基因植物。

当前第76页\共有186页\编于星期四\13点根癌致病区根癌的分解代谢区复制区GMFood

–生物技术当前第77页\共有186页\编于星期四\13点用与提取目的基因相同的限制酶切割载体（基因）使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在DNA连接酶的作用下连接形成重组DNA分子。GMFood

–生物技术2目的基因与运载体的结合载体目的基因重组体、重组子、重组DNA当前第78页\共有186页\编于星期四\13点基因重组体的鉴定与筛选重组质粒的快速鉴定重组质粒的限制酶解分析通过α互补是菌落产生颜色反应来筛选重组体外源DNA片段插入失活分子杂交筛选法表达文库的免疫学筛选利用PCR方法来确定基因重组体DNA的序列分析GMFood

–生物技术当前第79页\共有186页\编于星期四\13点蓝白斑筛选的原理

蓝白斑筛选的原理分类:生物科学蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法：是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。现在使用的许多载体都带有一个大肠杆菌的DNA的短区段，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。蓝白斑试验（IPTG-Xgal试验）当前第80页\共有186页\编于星期四\13点这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。蓝白斑筛选的原理当前第81页\共有186页\编于星期四\13点

乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖

乳糖类似物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）有更强的诱导作用。

IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。

LacZ基因编码的乳糖苷酶

X-gal

蓝色吲哚产物蓝白斑筛选的原理当前第82页\共有186页\编于星期四\13点诱导物

ZYX

PO

ZYX

PO乳糖当前第83页\共有186页\编于星期四\13点标志补救（ß-半乳糖苷酶法）lacZAmN2H片段COOH片段lacZ当前第84页\共有186页\编于星期四\13点X-galLacZ蓝色化合物X-gal当前第85页\共有186页\编于星期四\13点（LacZ基因N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因N端序列LacZ酶当前第86页\共有186页\编于星期四\13点GMFood

–生物技术3受体细胞和重组DNA的导入

重组基因的高效表达与所用的受体细胞关系密切。从原核细胞到真核细胞，从简单的真核细胞如酵母菌到高等的动、植物细胞，都可以作为基因工程的受体细胞。选择适当的受体细胞与适当的重组基因导入方法是重组基因高效扩增和表达的前提。受体细胞的选择重组DNA导入受体细胞导入扩增当前第87页\共有186页\编于星期四\13点3.1受体细胞选择的原则GMFood

–生物技术表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因型要匹配，易于对重组体进行筛选；受体的遗传稳定性高，易于进行扩大发酵（或培养），易于进行高密度发酵而不影响外源基因的表达效率；受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量要低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累；受体细胞应能使外源基因高效分泌表达；当前第88页\共有186页\编于星期四\13点受体细胞对培养的适应性强，可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养（针对动物细胞）；受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏倚性；受体细胞无致病性；具有好的转译后加工机制等。GMFood

–生物技术当前第89页\共有186页\编于星期四\13点3.2重组基因导入受体细胞的方法GMFood

–生物技术裸DNA直接注射法微粒轰击法电穿孔法显微注射法物理方法化学方法磷酸钙共沉淀法磷酸钙或DEAE--葡聚糖转染法脂质体转染法

生物方法质粒载体介导法病毒介导法花粉管通道法叶绿体基因组转移法

当前第90页\共有186页\编于星期四\13点裸DNA直接注射到受精卵中GMFood

–生物技术DNA直接注射到受精卵中当前第91页\共有186页\编于星期四\13点。GMFood

–生物技术微粒轰击（particlebombardment）基因枪当前第92页\共有186页\编于星期四\13点电穿孔(electroperation)

该方法利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，使细胞膜上形成纳米大小的微孔，可将DNA转移到细胞中。该方法简便，且有较稳定的转染效率，可广泛运用于培养细胞的基因转移。GMFood

–生物技术当前第93页\共有186页\编于星期四\13点GMFood

–生物技术显微注射指在显微镜下，将DNA用玻璃针直接注入细胞。可以将DNA直接注入核内而减少溶酶体对外源DNA的降解，有助于基因的整合与表达。适用于多种贴壁生长细胞及悬浮生长细胞，包括原代及传代细胞、胚胎细胞等。当前第94页\共有186页\编于星期四\13点磷酸钙共沉淀法GMFood

–生物技术当前第95页\共有186页\编于星期四\13点脂质体载体包埋法GMFood

–生物技术当前第96页\共有186页\编于星期四\13点载体介导法GMFood

–生物技术烟草原生质体与Ti质粒共转移培养法当前第97页\共有186页\编于星期四\13点花粉管通道法GMFood

–生物技术当前第98页\共有186页\编于星期四\13点GMFood

–生物技术4目的基因的表达和检测

处理的受体细胞中是否真正导入了目的基因，导入了多少目的基因，需进行检测——针对目的基因。

目的基因能否在受体内进行表达（复制、翻译），需进行检测——针对表达产物。

表达产物的进一步的代谢是否产生最终目标产物，需检测——针对最终转基因产品的性状。4.1进行检测的原因当前第99页\共有186页\编于星期四\13点染色体基因水平：

是否整合了外源基因以及整合的位点和拷贝数。转录水平：

转基因的mRNA的存在与否以及表达水平。翻译水平：

转基因的蛋白质的表达以及功能检测。个体水平：

抗虫能力、抗病能力、产物活性等。GMFood

–生物技术4.2进行检测分析的策略核酸（DNA），位于细胞核Nucleus蛋白质

功能产物mRNA（信使RNA）由DNA转录而来当前第100页\共有186页\编于星期四\13点外源基因表达产物检测的过程就是对特异性mRNA或蛋白质的检测。检测特异性mRNA的方法Northern杂交法检测特异性蛋白质的方法生化反应检测法免疫学检测法生物学活性检测法当转化的外源目的基因表达产物没有可供直接检测的性质时，可把外源基因与标记基因或报告基因一起构成嵌合基因，通过检测嵌合基因中的标记基因或报告基因间接确定外源目的基因的存在和表达。GMFood

–生物技术PT-PCR法4.3检测分析的技术方法当前第101页\共有186页\编于星期四\13点免疫学检测免疫沉淀法酶联免疫吸附法Western沉淀法固相放射免疫法GMFood

–生物技术当前第102页\共有186页\编于星期四\13点抗原和抗体当前第103页\共有186页\编于星期四\13点

一、抗原(Antigen，Ag)‏

能刺激机体免疫系统并启动机体的免疫应答，且能与其免疫应答产物(抗体或免疫效应细胞)特异性结合，并发生一系列生物学效应的物质。当前第104页\共有186页\编于星期四\13点T细胞B细胞AgTBT浆细胞致敏T细胞抗体当前第105页\共有186页\编于星期四\13点

（一）抗原的两种基本特性

1.免疫原性

指抗原分子能够刺激机体产生免疫应答(产生特异性抗体及免疫效应细胞)的性质。

AgTBT浆细胞致敏T细胞抗体当前第106页\共有186页\编于星期四\13点

2.抗原性(又称免疫反应性)

指抗原分子与免疫应答产物(抗体或免疫效应细胞)发生特异性结合的性质。AgTBT浆细胞致敏T细胞抗体当前第107页\共有186页\编于星期四\13点3、完全抗原与半抗原

1）完全抗原（completeantigen)具有免疫原性和抗原性的物质。

2）半抗原（hapten，又称不完全抗原incompleteantigen）无免疫原性，只有抗原性的物质。半抗原+蛋白质→完全抗原当前第108页\共有186页\编于星期四\13点半抗原

+载体抗体BT完全抗原BBBT当前第109页\共有186页\编于星期四\13点（二）决定免疫原性的条件1.抗原本身的理化性质2.抗原与机体的相互作用（免疫方式）

当前第110页\共有186页\编于星期四\13点皮内＞皮下＞肌肉＞腹腔＞静脉（1）宿主因素:（2）进入机体途径:

（3）佐剂：增强机体对抗原的免疫应答或改变免疫应答类型，如氢氧化铝、一些细胞因子等当前第111页\共有186页\编于星期四\13点外源性分子大小

MW.>5000-10000化学组成与复杂性

如异聚物比同聚物免疫原性更强抗原加工和递呈的敏感性

如不可溶的大分子通常是比可溶性小分子免疫原性更强（不可溶的大分子易于吞噬和加工）；不能被降解递呈的大分子物质免疫原性很低。导致免疫原性的抗原特性当前第112页\共有186页\编于星期四\13点外源性(Foreignness)机体对“我/非我”(self/nonself)的识别导致免疫反应

我耐受

(在淋巴细胞发育期间未成熟淋巴细胞与自身成分相接触)

非我反应

(抗原在这一关键时期没有与未成熟淋巴细胞相接触)免疫原与被免疫动物之间在系统发育上距离的远近，免疫原保守性的强弱，影响免疫原性的强弱。当前第113页\共有186页\编于星期四\13点（三）抗原的特异性结构基础：抗原决定簇

特异抗原只能刺激机体产生特异性抗体或致敏淋巴细胞，且仅能与该特异性抗体或淋巴细胞结合并相互作用当前第114页\共有186页\编于星期四\13点抗原决定簇（AD）概念：抗原分子中决定抗原特异性的特殊化学基团，又称为表位AD的数目、性质和空间构象决定抗原特异性抗原以AD与相应抗原受体及抗体特异性结合当前第115页\共有186页\编于星期四\13点（二）共同抗原与交叉反应

1.共同抗原(Commonantigens)：

存在于两种不同的抗原之间的相同或相似的抗原决定簇，称为共同抗原。

2.交叉反应(Cross-reaction)：

由于存在共同抗原造成抗体对具有相同或相似决定簇的不同抗原发生反应，此称为交叉反应。

意义：致病性；应用诊断当前第116页\共有186页\编于星期四\13点（四）抗原的种类1、根据抗原刺激B细胞产生抗体是否需要T细胞辅助

胸腺依赖性抗原：如，多数蛋白质抗原胸腺非依赖性抗原：如，细菌脂多糖，聚合鞭毛素

2、根据与人体的亲缘关系

异种抗原：来自不同种属的抗原

同种异型抗原：来自同一种属不同个体的抗原

自身抗原：隐蔽性抗原和变性抗原异嗜性抗原：不同种属间的共同抗原3、根据抗原是否由抗原呈递细胞合成

外源性抗原：与MHC-Ⅱ类分子结合，由CD4+T细胞识别

内源性抗原：与MHC-I类分子结合，由CD8+T细胞识别当前第117页\共有186页\编于星期四\13点同种异型异种抗原当前第118页\共有186页\编于星期四\13点新生儿溶血症

孕妇(Rh-)‏胎儿(Rh+)‏抗Rh抗体（IgG）新生儿RBC(Rh+)‏溶血反应＋当前第119页\共有186页\编于星期四\13点当前第120页\共有186页\编于星期四\13点二、抗体(Antibody，Ab)

机体免疫细胞被抗原激活后，由B细胞分化成熟的浆细胞合成、分泌的一类能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。

当前第121页\共有186页\编于星期四\13点

免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)(1)定义：具有抗体活性或化学结构与抗体分子相似的球蛋白。

(2)存在形式：

膜型—B细胞膜上的抗原受体

分泌型—分泌进入体液,

介导体液免疫应答当前第122页\共有186页\编于星期四\13点当前第123页\共有186页\编于星期四\13点1、免疫球蛋白的分子结构1）重链（H链）和轻链（L链）2）可变区（V区）和恒定区（C区）3）铰链区4）水解片段当前第124页\共有186页\编于星期四\13点1、免疫球蛋白的分子结构当前第125页\共有186页\编于星期四\13点当前第126页\共有186页\编于星期四\13点2、免疫球蛋白的生物学特征1）主要功能

V区：特异性识别、结合Ag

C区：激活补体、调理作用、ADCC等2）各类免疫球蛋白的特性和功能当前第127页\共有186页\编于星期四\13点IgG血清和胞外液中的主要抗体成分，可通过经典途径激活补体自出生三个月开始合成，3-5岁接近成人水平。是唯一能通过胎盘的Ig，在自然被动免疫中起重要作用（新生儿抗感染）。主要的抗感染抗体(具有抗菌、抗病毒、中和毒素和免疫调理作用)，参与II、III型超敏反应当前第128页\共有186页\编于星期四\13点IgM是个体发育中最早产生的抗体，胚胎晚期已能合成，新生儿脐带血中若IgM水平升高，提示胎儿曾有宫内感染IgM是抗原刺激后出现最早的抗体，半衰期短，故检测IgM水平可用于传染病的早期诊断有很强的抗原结合能力，比IgG更易激活补体也可参与II、III型超敏反应IgM当前第129页\共有186页\编于星期四\13点分为血清型和分泌型两种。sIgA主要存在于唾液、泪液、以及呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜表面的分泌液中参与皮肤粘膜的局部抗感染作用初乳中含有高浓度的sIgA母乳喂养IgA当前第130页\共有186页\编于星期四\13点一、抗体的制备1、抗血清（多克隆抗体）：由抗原直接免疫动物获得2、单克隆抗体：小鼠免疫脾细胞＋骨髓瘤细胞＝杂交瘤细胞当前第131页\共有186页\编于星期四\13点（一）抗血清的制备1、免疫原的制备：免疫物质＋佐剂2、动物免疫：兔、羊3、试血及效价测定4、免疫动物血液采集和抗血清的分离当前第132页\共有186页\编于星期四\13点（二）单克隆抗体的制备当前第133页\共有186页\编于星期四\13点二、抗体的纯化1、非专一方法（化学方法）：提纯或浓缩某一类的免疫球蛋白2、专一方法：利用免疫吸附剂和亲和层析色谱的方法得到免疫学上专一性的抗体。当前第134页\共有186页\编于星期四\13点（一）IgG的化学分离1、冷酒精沉淀法2、中性盐分段沉淀法简便、常用利用硫酸铵或硫酸钠沉淀免疫球蛋白。当前第135页\共有186页\编于星期四\13点（二）利用免疫吸附剂纯化特异性抗体

1、利用特异性抗原纯化特异性抗体抗原与不溶性载体结合，制成特异性的免疫吸附剂。当前第136页\共有186页\编于星期四\13点2、利用特定的细菌蛋白纯化特异抗体从葡萄球菌中分离出的A蛋白和从链球菌中分离出的G蛋白在一定条件下可与各种免疫球蛋白的Fc端相结合。A蛋白与不溶性载体结合后可以纯化免疫球蛋白。商品A蛋白载体：Sepharose4B当前第137页\共有186页\编于星期四\13点基本原理它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）酶联免疫吸附分析法（ELISA）当前第138页\共有186页\编于星期四\13点当前第139页\共有186页\编于星期四\13点当前第140页\共有186页\编于星期四\13点酶结合物是酶与抗体或抗原联结的产物。具有酶促反应，显示出生物放大作用。在ELISA中，常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和碱性磷酸酶(alkalinephosohatase,AP)。1、HRP催化过氧化物的氧化反应。供氢体：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，最适吸收波长为492nmTMB经HRP作用后共产物显蓝色，用HCL或H2SO4终止后，由蓝色呈黄色，最适吸收波长为405nm2、AP为磷酸酯酶一般采用对硝基苯磷酸酯(p-NPP)作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应当前第141页\共有186页\编于星期四\13点DNM-9602G酶标分析仪DNM-9602标配酶标分析仪

DNM-9602A酶标分析仪酶标分析仪当前第142页\共有186页\编于星期四\13点表达产物生物学活性检测当外源基因的表达产物是一种酶蛋白时，可根据酶的催化反应来确定外源基因表达与否和表达的程度。该方法简便且易于操作，在反应体系中加入特定的底物和基因表达产物的抽提物就可根据反应现象进行定性和定量的分析。GMFood

–生物技术当前第143页\共有186页\编于星期四\13点基因表达产物的分离纯化基因表达产物分离纯化的步骤：细胞破碎离心分离柱层析电泳细胞的破碎对于进行分泌型表达的细胞来说，这一步可以省略。对于非分泌型表达的细胞可采用不同的细胞破碎方法。常见的细胞破碎方式变性剂裂解法超声波破碎法机械破碎法酶裂解法GMFood

–生物技术当前第144页\共有186页\编于星期四\13点GelFiltration(GF)GFseparatesproteinswithdifferencesinmolecularsize.Thetechniqueisidealforthefinalpolishingstepsinapurificationwhensamplevolumeshavebeenreduced(samplevolumesignificantlyinfluencesspeedandresolutioningelfiltration).Samplesareelutedisocratically(singlebuffer,nogradient).Bufferconditionsarevariedtosuitthesampletypeortherequirementsforfurtherpurification,analysisorstoragestep,sincebuffercompositiondoesnotdirectlyaffectresolution.Proteinsarecollectedinpurifiedforminthechosenbuffer.当前第145页\共有186页\编于星期四\13点凝胶过滤法样品当前第146页\共有186页\编于星期四\13点凝胶过滤层析的原理示意图当前第147页\共有186页\编于星期四\13点凝胶过滤层析洗脱峰示意图当前第148页\共有186页\编于星期四\13点型号分离范围SuperdexPeptide10/300GL100-7000Superose1210/300GL1kd-300kDSuperose610/300GL5kd-5000kDSuperdex7510/300GL3kd-70kDSuperdex20010/300GL10kd-600kD凝胶过滤填料当前第149页\共有186页\编于星期四\13点凝胶过滤色谱的优缺点优点

1）分离条件温和，蛋白质回收率高2）重现性好3）易于操作缺点1）处理量小2）时间长当前第150页\共有186页\编于星期四\13点凝胶过滤影响因素用凝胶过滤时如何缩小上样体积，因为凝胶层析柱的上样体积只能是柱床体积的1/10～1/6，也可以使用串联柱以加大柱床体积。当前第151页\共有186页\编于星期四\13点AffinityChromatography(AC)ACseparatesproteinsonthebasisofareversibleinteractionbetweenaprotein(orgroupofproteins)andaspecificligandattachedtoachromatographicmatrix.Thetechniqueisidealforacaptureorintermediatestepandcanbeusedwheneverasuitableligandisavailablefortheprotein(s)ofinterest.ACoffershighselectivity,hencehighresolution,andusuallyhighcapacityfortheprotein(s)ofinterest.当前第152页\共有186页\编于星期四\13点当前第153页\共有186页\编于星期四\13点亲和层析的洗脱峰当前第154页\共有186页\编于星期四\13点当前第155页\共有186页\编于星期四\13点M，中分子量marker2,Defensin-GST蛋白表达方式：可溶性大量（左考染，中银染，右GSTWesternblotting)Defensin-GST当前第156页\共有186页\编于星期四\13点Tricine-SDS

M，超低分子量Marker

1,pPICZaA空2,3Defensin发酵上清过柱后洗脱液

当前第157页\共有186页\编于星期四\13点GMFood

–生物技术第二节转基因植物一、转基因植物的发展转基因植物

将外源基因导入植物细胞，经组织培养，获得能够表达外源基因的植物。1983年，转基因烟草、胡萝卜问世1987年，转基因油菜、棉花产生1988年，转基因水稻、玉米诞生1992年，培育出转基因小麦1994年，培育出转基因大麦预测：2020年世界上80％-90％的农作物将是转基因植物

与传统的常规育种有何区别？——

转基因植物通常至少含有一种非近源物种的遗传基因。当前第158页\共有186页\编于星期四\13点植物转基因的基本技术路线GMFood

–生物技术二、植物转基因的技术当前第159页\共有186页\编于星期四\13点苏云金杆菌毒蛋白基因质粒载体重组质粒构建农杆菌棉花棉花细胞侵染转移转基因棉花抗虫棉的构建GMFood

–生物技术当前第160页\共有186页\编于星期四\13点植物转基因的受体系统◆组织受体系统（如：受伤的细胞容易受到病毒或质粒的感染，并形成愈伤组织，可诱导分化出完整植株）◆原生质体系统（便于体外细胞和遗传操作）◆生殖细胞受体系统（1、单倍体培养诱导愈伤组织、转化；2、利用花粉和卵细胞的受精过程转化：类似转基因动物？）◆叶绿体转化系统（能直接表达原核基因）GMFood

–生物技术当前第161页\共有186页\编于星期四\13点外源基因导入植物受体的方法◆直接转化法◆农杆菌介导转化法（1974年）◆基因枪法（1987年）◆植物病毒介导法GMFood

–生物技术当前第162页\共有186页\编于星期四\13点转基因植物的类型GMFood

–生物技术三、转基因植物的生产实践抗除草剂的转基因植物（最早进入田间生产，目前栽培面积最大）如Monsanto的抗除草剂草甘膦大豆抗虫转基因植物

如Syngenta的Bt176抗虫玉米抗病转基因植物

（抗病毒，抗真菌，抗细菌）抗环境胁迫转基因作物

（温度、水分、化学物）植物发育调节基因工程

（控制果实成熟，雄性不育，改良植物品质）医药领域中的转基因植物（利用植物作为生物反应器，生产药用蛋白、食用疫苗等）当前第163页\共有186页\编于星期四\13点转基因水稻与小麦GMFood

–生物技术当前第164页\共有186页\编于星期四\13点6/7/2023金大米

GMFood

–生物技术通过转基因技术将胡萝卜素转化酶系统转入到大米胚乳中