蛋白质样品的全息制备演示文稿

蛋白质样品的全息制备演示文稿当前第1页\共有153页\编于星期六\10点优选蛋白质样品的全息制备当前第2页\共有153页\编于星期六\10点2.蛋白质样品的要求：(1)收集到所有蛋白质，其中包括不同丰度、不同物化特性的蛋白。(2)蛋白质有活性，结构没有大的变化。(3)与其他大分子有机物有效分离，达到一定纯度。(4)与后续的分离或鉴定方法相匹配，当前第3页\共有153页\编于星期六\10点3.生物材料的选择

制备蛋白质材料的来源无非是动物、植物和微生物。如果用于科学研究则材料的选择可根据研究者的研究对象及目的要求选材。

动物组织要先除去结缔组织、脂肪等非活性部分。

植物要先去壳、除脂。

微生物材料要及时将菌体与发酵液分开,采用聚凝、絮凝、离心、过滤等方法。当前第4页\共有153页\编于星期六\10点结缔组织脂肪组织网状组织

网状纤维疏松结缔组织致密结缔组织(真皮、肌腱、巩膜)等当前第5页\共有153页\编于星期六\10点植物去壳、脱脂当前第6页\共有153页\编于星期六\10点微生物菌体与发酵液分开

当前第7页\共有153页\编于星期六\10点4.样品的采集（1）样品要有代表性和可比性样品的采集和处理是生化研究中的重要环节。在实际工作中，往往容易把注意力集中在具体的仪器测定上，而对采集和处理样品不够注意，结果导致了较大的实验误差，甚至造成整个测定结果的失败。采样时间、部位，具有可比性，如按生育时期、某组织或器官采样地点，一般在距田埂或地边一定距离，或在特定的取样区内取样。取样点的四周不应该有缺株的现象。当前第8页\共有153页\编于星期六\10点（2）样品的数量应当不少于供分析用样品的两倍（3）净化、保鲜，

取新鲜样品时，常沾有泥土等杂质，应用柔软湿布擦净，不应用水冲洗。样品采离生物体后应立即放于低温下，即应带液氮罐或冰盒到田间取样。样品如暂不提取，应在-80℃冰冻保存当前第9页\共有153页\编于星期六\10点第二节蛋白质样品裂解液成分分析一、概述双向凝胶电泳技术具有高分辨率、高重复性、微量分析和制备等性能，是蛋白质组研究中最主要的研究技术。双向凝胶电泳蛋白质样品制备非常强调“全息”性制备。当前第10页\共有153页\编于星期六\10点理想的样品制备方法应满足下列要求：（1）在合适盐浓度下可重复地溶解所有的蛋白质，并使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在。（2）避免溶解度低的蛋白质在等电聚焦时沉淀析出；即选择适当pH缓冲液；（3）防止蛋白质的化学修饰（4）排除核酸、多糖、脂类和其他干扰物质（5）获得的目标蛋白质在可探测水平，有时需要去除高丰度蛋白质和不相关蛋白质。当前第11页\共有153页\编于星期六\10点生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得当前第12页\共有153页\编于星期六\10点二、蛋白质样品制备量裂解液的成分

为获得最佳的双向电泳分离结果，样品一般使用促溶剂、去污剂、IPG缓冲液和两性电解质等将其变性并充分溶解,其功能是将蛋白质转化为肽。

但这些物质应满足一些化学和电学的要求，如适合IPG胶条的IEF技术、保持蛋白质最大的溶解性和尽可能低的离子强度（等电聚焦加以高压时，低离子强度使得电流很低，保证了聚焦的快速高效）。当前第13页\共有153页\编于星期六\10点1.离液剂

常用的离液剂（变性剂）主要为尿素，其主要作用是改变或破坏氢键等次级键的结构，使蛋白质去折叠，而变性或失活。通过引入硫脲，与尿素一起能有效的促进蛋白质于IPG中的溶解性，并可以提高不同亚细胞组分中蛋白质的溶解，包括膜镶嵌蛋白一类疏水性极强的蛋白质。样品裂解液包括下列成分当前第14页\共有153页\编于星期六\10点尿素和硫脲有效地破坏了疏水键，防止了聚集作用和二级结构的形成，聚集作用和二级结构的形成会改变蛋白质的迁移性，而硫脲在水中溶解度差，需要高浓度的尿素助溶，通常是将硫脲加入5-7mol/L的尿素溶液中，使其浓度达到2mol/L。为防止尿素引起蛋白质氨基甲酰化，可以向缓冲液中加入精胺。当前第15页\共有153页\编于星期六\10点2.还原剂作用在于还原二硫键或防止蛋白质氧化。

蛋白质经去折叠后，暴露了疏水部分，为使蛋白质完全去折叠，还有必要对二硫键用还原剂进行还原。β-巯基乙醇及DTT为常用的还原剂。当前第16页\共有153页\编于星期六\10点但β-巯基乙醇及DTT带电荷，在等电聚焦的过程中，能迁移到pH梯度以外，从而使部分蛋白质的溶解性下降而不能很好的聚焦。当前第17页\共有153页\编于星期六\10点

Herbert(1998)用三丁基膦（TBP）替代了DTT一类的还原剂。TBP提高了蛋白质的溶解度，并且提高了蛋白从第一向向第二向的转移率，同时因为它不含硫，故不会被烷基化，将平衡步骤简化为一步。当前第18页\共有153页\编于星期六\10点3.去污剂

主要作用①破坏蛋白质分子间的疏水相互作用，②提高蛋白质的溶解性，有助于溶解膜蛋白质，并有助于膜蛋白质与脂类的分离，③防止蛋白质在等电聚焦时析出。去污剂将蛋白质去折叠之后，有大量的疏水基团暴露，为使蛋白质有较高的溶解性，就需要在缓冲液中加入去污剂。当前第19页\共有153页\编于星期六\10点

去污剂有离子型、非离子型和兼性离子型。常用的有阴离子型去污剂SDS，非离子型去污剂NP-40及TritonX-100，两性离子去污剂CHAPS

。

原则上去污剂应该是非离子型或兼性离子型的，这样才不会影响蛋白质迁移到它们各自的等电点位置。

当前第20页\共有153页\编于星期六\10点离子型的SDS虽不利于等电聚焦，但SDS的缓冲液可抑制蛋白质被内原性蛋白酶降解，并能提高蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性，故常用于样品处理的初级阶段。当前第21页\共有153页\编于星期六\10点4.两性电解质载体作用：

①能够促进蛋白质溶解，②吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子，③离心时还有助于核酸的沉淀。④它还可阻止样品蛋白质和IPG胶条中固化的两性电解质的相互作用。当前第22页\共有153页\编于星期六\10点两性电解质，同时带有可解离为负电荷和正电荷基团的电解质。如氨基酸两性电解质载体（Ampholime）；为一种相对分子质量小于1000的，人工合成的多氨基多羧酸系列两性化合物的复杂混合物。实际含量为40%的溶液。性状：近无色至浅黄色透明液体。有粘性。当前第23页\共有153页\编于星期六\10点作用原理

它在大于其等电点的pH环境中解离成带负电荷的阴离子，向电场的正极泳动，在小于其等电点的pH环境中解离成带正由荷的阳离子，向电场的负极泳动。这种泳动只有在等于其等电点的pH环境中，即蛋白质所带的净电荷为零时才能停止。当前第24页\共有153页\编于星期六\10点

MargaretM.Shawetal(2003)在缓冲液中加入两性电解质载体，可以阻止疏水性蛋白质与IPG胶条的基质发生作用（通常发生在碱性端），这样可以减少因为沉积而引起的条纹现象，同时还可以与核酸结合，高速离心可以除去这种复合物，减少核酸引起的污染。当前第25页\共有153页\编于星期六\10点即便在变性剂和表面活性剂存在的情况下，某些蛋白质也需要在盐离子的作用下才能保持其处于溶解状态，否则这些蛋白质在其处于PI点时会发生沉淀。两性电解质载体可增加蛋白质溶解性。当前第26页\共有153页\编于星期六\10点两性电解质的浓度增加可增加分辨率当前第27页\共有153页\编于星期六\10点两性电解质必备的条件：①可溶性要好，为了保证等电聚焦过程中PH梯度的形成和蛋白样品的迁移，载体两性电解质必须具有很好的溶解性能。②紫外吸收低，不发荧光。由于制备分离时，检测蛋白质的方法通常是测量280cm的吸光度，因此要求载体两性电解质在280cm的吸光度尽可能低。③在等电点处必需有足够的缓冲能力，以便能控制pH梯度，而不致被样品蛋白质或其他两性物质的缓冲能力改变pH梯度的进程。④在等电点必需的足够高电导，以便使一定的电流通过，而且要求具备不同pH值的载体有相同的电导系数，使整个体系中的电导均匀，如果有局部电导过小，就会产生极大的电位降，从而其他部分电压就会太小，以致不能保持梯度，也不能使应聚焦的成分进行电迁移，达到聚焦。当前第28页\共有153页\编于星期六\10点⑤分子量要小，便于与被分离的高分子物质用透析或凝胶过滤法分开。⑥化学组成应不同于被分离物质，不干扰测定。⑦无毒、无生物学效应。载体两性电解质对哺乳动物的组织培养，酶活性测定，免疫检测或注射到小白鼠或大鼠中都没有影响。⑧应不与分离物质反应或使之变性。总起来说，当一个两性电解质的等电点介于两个很近的pk值之间时，它在等电点的解离度大，缓冲能力强，而且电导系数高，这就是好的载体两性电解质。当前第29页\共有153页\编于星期六\10点三、不同组织蛋白质样品裂解液（一）植物组织蛋白质样品裂解液1.玉米叶片裂解液

尿素(9.0mal/L)

硫脲(2.0mal/L)

DTT(100.0mmal/L)

去污剂(CHAPS)4%

pH3-10两性电解质溶液(0.5%)。当前第30页\共有153页\编于星期六\10点2.水稻叶片和根系尿素(7.0mal/L)硫脲(2mal/L)CHAPS(5%)两性电解质溶液(5%,Amphalines,pH3.5-10)巯基乙醇(2%)。当前第31页\共有153页\编于星期六\10点3.大豆胚轴尿素(4.8g/0.2mL)NP-40(0.2mL)两性电解质溶液(0.2mL,Amphaline,pH3.5-8)巯基乙醇(0.5mL)少许PVP(聚乙烯吡咯烷酮)。当前第32页\共有153页\编于星期六\10点4.葡萄果实尿素(7.0mal/L)硫脲(2.0mal/L)DDT(65mmal/L)TritanX-I00(0.5%)CHAPS(4%)两性电解质溶液(5%,Ampholine,pH3-10)当前第33页\共有153页\编于星期六\10点5.桑树叶尿素(7mal/L)硫脲(2mal/L)CHAPS(40mg/mL)DTT(2mg/mL)

IPG缓冲液(pH3.5--10,1%)PVP(聚乙烯吡咯烷酮,50mg/L)。当前第34页\共有153页\编于星期六\10点6.花粉尿素(8.0mal/L)硫脲(2.0mal/L)DTT(30mmol/L)Tris(20mmal/L)

CHAPS(4%)两性电解质溶液(5%,Bio-Lyte,pH3—l0)当前第35页\共有153页\编于星期六\10点(二)微生物样品蛋白质裂解1.植物病原细菌(1)Burkholderiaglumae(细菌性谷枯病菌）:尿素(8.0mal/L)硫脲(2.0mol/L)DDT(100mmal/L)CHAPS(2%,V/V)IPG缓冲液(2%,V/V,pH4-7)0.002%(w/V)溴酚蓝。当前第36页\共有153页\编于星期六\10点2)Pantoeastewartii

（细菌性枯萎病菌）:尿素(5mal/L)硫脲(2mal/L)CHAPS(2%)SB3--10(2%)Tris(40mmal/L)两性电解质溶液(0.2%,Bio-Lyte3-10)当前第37页\共有153页\编于星期六\10点2.植物病原真菌(1)弯抱菌(Curularialunata):尿素(8mmol/L)、硫脲(2mal/L)DTT(100mmal/L)CHAPS(0.4%)两性电解质溶液CarrierAmpholyte(40%)溴酚蓝(0.001%)Tween-20(0.25%)异丙醇(10%)甘油(5%)当前第38页\共有153页\编于星期六\10点(2)灰霉菌(Botrytiscinerea):尿素(8mmol/L)DTT(20mmol/L)CHAPS(2%)两性电解质溶液(0.5%,Bio-Lyte)当前第39页\共有153页\编于星期六\10点3.生物防治微生物(1)链霉菌(Streptomycesavermitilis):尿素(8mol/L或7mol/L)硫脲(2mol/L)CHAPS(2%)DTT(50mmol/L)两性电解质溶液Ampholytes(1%)。当前第40页\共有153页\编于星期六\10点(2)木霉菌:尿素(9.0mol/L)CHAPS(2%)DDT(1%)苯甲基磺酸氟(PMSF,10mmol/L)。当前第41页\共有153页\编于星期六\10点(三)动物样品蛋白质裂解1.绵羊细胞Tris-HCl(10mmol/L,pH7.4)NP-40(0.5%)NaCl(0.15mol/L)NaN3(0.1%)DNase和蛋白酶抑制剂(20μg/mL)。当前第42页\共有153页\编于星期六\10点2.牛肝组织尿素(8mol/L)CHAPS(4%w/V)DTT(65mmol/L)Tris-HCl(50mmol/L)、少量溴酚蓝。当前第43页\共有153页\编于星期六\10点5.昆虫细胞(1)家蚕丝腺或胚胎细胞尿素(8mol/L)硫脲(2mol/L)CHAPS(40g/L)Trisbase(20mmol/L)DTE(30mmol/L)两性电解质溶液(Pharmalyte,pH3-10,2%)。当前第44页\共有153页\编于星期六\10点(2)蜂蜜:尿素(8mol/L)CHAPS(2%)溴酚蓝(0.001%)DTT(45mmol/L)两性电解质溶液(0.2%,Bio-Lyte,pH3-10)当前第45页\共有153页\编于星期六\10点第二节细胞裂解与蛋白质提取一、细胞破碎的方法

不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相同。如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。当前第46页\共有153页\编于星期六\10点1.温和的裂解方法主要用于易破碎的细胞。如组织培养细胞、血细胞、微生物等。也可用于亚细胞分离产物，如线粒体、高尔基体和膜等。当前第47页\共有153页\编于星期六\10点

1)反复冻融法：将待破碎的细胞冷至－15℃到－20℃，然后放于室温(或40℃)迅速融化，如此反复冻融多次，由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。该方法比较适用于细胞壁较脆弱易破的微生物菌体。但是该法存在破碎率低的问题，有时还会造成部分蛋白质失活。当前第48页\共有153页\编于星期六\10点将待破碎的细胞先置于高渗溶液中，然后转入低渗缓冲液中或水中，由于渗透压发生改变，溶剂分子大量进入细胞，将细胞破裂，释放出细胞内含物。该方法适用于分析制备蛋白质。0.5ml细胞液悬浮于20%蔗糖，30mmol/LTris-HCl(pH8,1mmol/LEDTA,0.1%tritonX100)溶液中室温下1h10000g离心3min沉淀（细胞）悬浮于2ml冷水中冰浴中和搅拌10min4℃下5000g离心3min溶解蛋白上清液2)渗透压冲击法(溶胀法)：当前第49页\共有153页\编于星期六\10点3)去污剂法利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶剂或SDS（十二烷基硫酸钠）等表面活性剂处理细胞，可将细胞膜溶解，从而使细胞破裂，此法也可以与研磨法联合使用。当前第50页\共有153页\编于星期六\10点

4)酶消化法：

利用各种水解酶，如溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶和酯酶等，一般于37℃，pH3～10，处理15分钟～几小时，可以专一性地将细胞壁分解。该法专一性强，操作条件温和，效率高。但成本较高。且需先做预备试验，以确定合适的酶解温度、pH及酶用量。当前第51页\共有153页\编于星期六\10点2.强烈的破碎方法1)超声波处理法：此法是借助超声波造成细胞悬浮液中气泡的增大和爆裂，通过机械剪切力破碎细胞壁和细胞器。可利用15-25KHz的超声波进行细胞破碎。破碎效率受声频、声能、处理时间长短、细胞类型及浓度等因素的影响。高粘度溶液或泡沫较多时破碎效率降低。另外，该过程易产热，可能会使蛋白质变性或水解。超声波法应以短脉冲，间隔冷却的方式。当前第52页\共有153页\编于星期六\10点具体操作，用于分析时，0.3ml细胞泥悬浮于3ml缓冲液中于冰浴中超声3次，每次1min，中间冷却1min。用于制备时，5ml细胞泥悬浮于50ml缓冲液中于冰浴中超声2次，每次4min，中间冷却4min。该法适用于微生物细菌和酵母细胞破碎，优点是破碎效果好,样品用量少。缺点是不适用于大规模的细胞破碎。当前第53页\共有153页\编于星期六\10点250D型超声波细胞破碎仪，数字式

●一般特点：

1)该细胞破碎仪功能强大，能用于许多液体处理应用：

2)生物细胞破碎、均质；

3)乳化；

4)加快反应；

5)分散；

6)精细混合；

7)去气；

小型超声波细胞破碎仪，数字式

当前第54页\共有153页\编于星期六\10点

2)高速珠磨法：该法较多用于酵母细胞的破碎，破碎效果好，影响破碎效果的因素有细胞浓度、珠磨机的搅拌速度、珠大小及操作温度。实验室中样品量少可在聚乙烯试管中进行，一般在试管中加入少量钢珠（0.2mm），预冷后或用冷却夹套，再窝旋。当前第55页\共有153页\编于星期六\10点在低温下,将剪碎的动植物组织置于研钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨或匀浆。低温的要求视目的而定,一般在4℃下,有的要求更低,在液氮中研磨。适用于动植物组织。匀浆机是利用研磨机理，对动植物组织进行柔软的匀化处理，得到实验需要的细胞浆、线粒体。适用于生物学、医学、农学等领域，具有低速大力矩，无噪音等特点。3)研磨当前第56页\共有153页\编于星期六\10点4)高压匀浆法（压榨法）：这是一种温和的、彻底破碎细胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa的高压下使细胞悬浮液通过一个小孔突然释放至常压，细胞将彻底破碎。适用于厚壁细胞、酵母、细菌和较浓样品的破碎。对于细胞膜结合的蛋白质，一般需要多次破碎。通常待破碎细胞湿重与缓冲液体积之比为1:2--1:5时即可。操作应尽可能在低温下进行，以免因为产生太多的热量而导致蛋白质失活。高压细胞破碎机，利用高压原理对细胞进行挤压破碎，具有快速，方便，无噪声的特点。当前第57页\共有153页\编于星期六\10点细胞破碎过程中一般都要释放出蛋白质酶,破坏目标蛋白,因此要获得良好的蛋白质分离效果,需要利用各种类型的抑制剂抑制蛋白质酶活性、保护目标蛋白结构的完整性。当前第58页\共有153页\编于星期六\10点

常规的缓冲液足以使蛋白酶钝化，但是有一些酶如组织蛋白酶C，几种羧肽酶及内源蛋白酶，胰蛋白酶等好几种酶都还有一定活性，故需加入一些蛋白酶抑制剂。常加PMSF或者是蛋白酶抑制剂“鸡尾酒”。当前第59页\共有153页\编于星期六\10点蛋白酶是一种独特的酶,主要有:①丝氨酸蛋白酶,如膜蛋白酶、廉蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶等;②半脱氨酸蛋白酶(就基蛋白酶),如木瓜蛋白酶、组织蛋白酶B;③天冬氨酸蛋白酶,如胃蛋白酶、组织蛋白酶D、血管紧张肤原酶、凝乳酶等,只存在于真核生物中,包括真核微生物,而原核生物中元该类蛋白酶;④金属蛋白酶,如嗜热菌蛋白酶、起肤酶A及细菌和动物细胞内的胶原酶等。当前第60页\共有153页\编于星期六\10点

抑制蛋白酶的方法①加入强变性剂(8mal/L尿素,10%的TCA或2%的SDS);②尽可能在低温下进行样品制备;③通过创造碱性环境(pH超过9.0)使蛋白酶失活,如在样品裂解液中加入Tris碱、两性电解质溶液和碳酸钠,但有些蛋白酶在强碱性条件下仍然有活性;④加入蛋白酶抑制剂。当前第61页\共有153页\编于星期六\10点蛋白酶抑制剂主要有以下几种PMSF(苯甲基磺酰氟)(2)金属蛋白酶抑制剂(3)AEBSF[4-(2-氨乙基)苯磺酰氟](4)肽蛋白酶抑制剂(5)Benzamidine(6)甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮(TLCK)(7)二异丙基磷酰氟(DFP)当前第62页\共有153页\编于星期六\10点(1)PMSF(苯甲基磺酰氟)是一种不可逆的抑制剂,常用浓度为1mmal/L,可抑制丝氨酸蛋白酶和一些半胱氨酸蛋白酶,但是该抑制剂在水溶液中易失活,因此只能现用现加。由于溶液中β-巯基乙醇会干扰PMSF的抑制效果,因此含巯基的试剂应在后几步加入。当前第63页\共有153页\编于星期六\10点1）抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；2）10mg/ml溶于异丙醇（或无水乙醇）中；3）在室温可保存一年；4）工作浓度：17-174ug/ml（0.1-1mM）；5）在水液体溶液中不稳定，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF。（见水分解，使用前加入）PMSF剧毒,

PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。当前第64页\共有153页\编于星期六\10点(2)金属蛋白酶抑制剂主要种类有乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇双四乙酸(EGTA),属于可逆抑制剂,通过整合自由的金属离子来抑制金属蛋白酶活性,常用浓度为1mmal/L。当前第65页\共有153页\编于星期六\10点(3)AEBSF[4-(2-氨乙基)苯磺酰氟]属于不可逆抑制剂,其作用机理与PMSF相似,但溶解性更好,且毒性较低。其不足之处是使蛋白质等电点发生改变。常用浓度为4mmol/L。当前第66页\共有153页\编于星期六\10点(4)肽蛋白酶抑制剂:主要种类有亮肽蛋白酶(leupepetin)、抑胃肽A(pepstainA)和抑蛋白酶肽(aprotinin),均为可逆的蛋白酶抑制剂。其中：亮肽蛋白酶在含有DTT的溶液中以低浓度的形式保持活性,抑制一些丝氨酸和半脱氨酸蛋白酶的活性;抑胃肽A抑制天冬氨酸酸性蛋白酶活性;抑蛋白酶肽主要抑制丝氨酸蛋白酶活性。当前第67页\共有153页\编于星期六\10点(5)Benzamidine:常用浓度为1-2mmol/L,抑制丝氨酸蛋白酶。当前第68页\共有153页\编于星期六\10点(6)甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮(TLCK)甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮(TPCK):属于不可逆抑制剂,主要抑制丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。常用浓度为0.1-0.15mmol/L。当前第69页\共有153页\编于星期六\10点(7)二异丙基磷酰氟(DFP)一种神经毒气,与酶活中心的丝氨酸的-OH非专一性结合。当前第70页\共有153页\编于星期六\10点从组织和细胞中提取蛋白质是蛋白质组研究中最关键的一步,因为这一步将影响蛋白质的产率、生物活性和特定目标蛋白结构的完整性。所以,选择细胞破碎方法和蛋白质提取方法的基本要求就是尽量减少对目标蛋白的破坏。二、蛋白质提取与沉淀方法当前第71页\共有153页\编于星期六\10点在制备蛋白质提取物的过程中,极端的pH、温度、机械压力、高压以及蛋白质的水解作用都可能干扰蛋白质的天然结构。即使蛋白质的降解不会影响它的生物学活性,也可能影响目标蛋白与细胞内其他组分的相互关系,从而导致同一样品两批次提取得到不同的结果。因此,细胞裂解的方法对提取的蛋白质的质量有很大影响。当前第72页\共有153页\编于星期六\10点用于提取可溶性蛋白的组织选择有几个标准①目标蛋白在不同组织中的分布是不同的,因而需要进行小规模的预实验检测不同组织中目标蛋白的相对含量;②原材料的最终选择往往需要在几个方面进行权衡,即目标蛋白的丰度、是否易于获得、价格因素、目标蛋白是否易被蛋白酶降解等;③尽量使用新鲜组织,某些条件下可使用冰冷组织,但需要迅速将组织切成小块冰冻,一般不易放置过久;④某些情况下,最好在破碎细胞前先温和地破碎组织以得到大量完整细胞。影响目标蛋白从细胞中释放的因素很多,如盐溶度、去污剂的类型、二价阳离子和pH。当前第73页\共有153页\编于星期六\10点大多数情况下都是采用一步法进行蛋白质样品的制备,但由于不同蛋白质的溶解度及丰度常常存在较大的差异,因此目前也有采用细胞分级或蛋白质组分分级顺序提取,目的是为了尽量把细胞中的全部蛋白质提取出来。当前第74页\共有153页\编于星期六\10点(一)一步沉淀方法蛋白质沉淀的目的主要是为随后的双向电泳分离提供高浓度和高纯度的蛋白质。通过沉淀过程蛋白质样品可去除大部分的盐离子、核酸、脂类等杂质,从而确保双向电泳图谱的质量。但需要注意的是,如果蛋白质沉淀方法选择不当,很可能使沉淀下来的蛋白质很难或无法再溶解或悬浮。当前第75页\共有153页\编于星期六\10点常用的蛋白质沉淀的方法有1.硫酸铵沉淀在高盐溶液中,蛋白质因聚合而从溶液中沉淀下来。通过洗涤沉淀的蛋白质可去除杂质。可根据需求向蛋白质溶液中缓慢加入硫酸铵至不同的饱和度,注意达到某一饱和度需要加入的硫酸铵量与环境温度有关。加入硫酸铵时最好在磁力搅拌器上操作,边加边搅拌,这样可防止蛋白质变性。需要注意,蛋白质上残留的硫酸铵会干扰等电聚焦,因此必须通过透析的方法去除。当前第76页\共有153页\编于星期六\10点2.三氯乙酸(TCA)沉淀利用TCA沉淀蛋白质的量明显超过硫酸铵沉淀法。一般是将TCA加到提取液中,终浓度达10%-20%,冰浴上沉淀30min,通过离心便可获得蛋白质。组织样品也可以直接用10%-20%的TCA进行匀浆。TCA沉淀蛋白质的不足之处是蛋白质很难再溶或悬浮,并且,如果沉淀时间过长会造成化学修饰。一般在TCA沉淀后,要用丙酮清洗沉淀,以除去TCA。当前第77页\共有153页\编于星期六\10点3.丙嗣沉淀丙酮是蛋白质组学研究中最常用的提取或沉淀蛋白质的有机溶剂。一般需要向蛋白质溶液加入3-4倍体积的冰丙酮,然后在-20°C静置2h以上,离心沉淀蛋白质,最后通过空气干燥或冻干法除去丙酮。当前第78页\共有153页\编于星期六\10点4.丙酮与TCA联用由于TCA所沉淀蛋白质的难溶性,因此人们将丙酮和TCA结合使用,这样可在发挥TCA沉淀蛋白质强度高的优点同时,通过加入丙酮提高沉淀蛋白质的再溶性。当前第79页\共有153页\编于星期六\10点通常是利用丙酮配制浓度10%的TCA提取液。至少在-20°C沉淀45min,通过离心沉淀蛋白质,然后用含有0.01%β-巯基乙醇溶液或20mmol/LDDT的冰丙酮清洗沉淀。通过空气干燥或冻干去除残留的丙酮。当前第80页\共有153页\编于星期六\10点5.乙酸铵沉淀用乙酸铵的甲醇溶液沉淀蛋白质,同时用酚抽提。沉淀的蛋白质需要用甲醇-乙酸铵液洗涤若干次,然后再用丙酮清洗,并蒸发除去丙酮。当前第81页\共有153页\编于星期六\10点(二)分步提取法常规方法分离的蛋白质多数是以亲水性蛋白为主,而且仅占所鉴定总蛋白量的一小部分,对于疏水性蛋白丢失比较严重。尽管对细胞器和质膜预分级可减少样品的复杂性,然而,这要求丰富的经验和超速离心机等价格昂贵的仪器。所以有人提出了利用蛋白质溶解性的差异进行分离,即分步法或顺序法提取蛋白质当前第82页\共有153页\编于星期六\10点蛋白质的分步提取法的具体操作步骤分步提取法采用的裂解液的溶解性是逐渐增加的,第一步:溶解偏亲水性蛋白第二步:溶解亲水性、中性和疏水性的蛋白质。第三步:主要溶解偏疏水性的蛋白质。第四步:溶解常规提取不能溶解的膜蛋白、不溶性蛋白当前第83页\共有153页\编于星期六\10点第一步:水溶液的提取加入裂解液I(40mmol/LTris)、DNase和RNase溶解偏亲水性蛋白。当前第84页\共有153页\编于星期六\10点第二步:含尿素/CHAPS/DTT溶液的提取。

加入裂解液II(8mol/L尿素,4%CHAPS,100mmol/LDTT,40mmol/LTris,0.5%PharmalytepH3--10,20μg/mLDNaseI和5μg/mLRNaseA),剧烈振荡、混匀,离心收集上清液。溶解亲水性、中性和疏水性的蛋白质。当前第85页\共有153页\编于星期六\10点第三步:加入裂解液Ⅲ(5mol/L尿素,2%硫脲,2%CHAPS,2%SB3-10,2mmol/LTBP,40mmol/LTris,0.5%PharmalytepH310,20μg/mLDNaseI和5μg/mLRNaseA),剧烈振荡、混匀,离心收集上清液。保存于-70°C。SB3-10、还原剂DTT、解聚剂硫脲主要溶解偏疏水性的蛋白质。当前第86页\共有153页\编于星期六\10点第四步:在必要情况下,将第二步未溶解的细胞沉淀再用1%SDS、50mmol/LDTT、25%甘油及0.4mol/LTris-HCl(pH8.8)溶解抽提,这样可使与细胞膜或细胞器中结合很牢的常规提取不能溶解的膜蛋白、不溶性蛋白能溶解出来。当前第87页\共有153页\编于星期六\10点基本步骤可依据样品类型而变化,在多数情况下,大部分蛋白质在第一步和第二步操作中就可以提取出来,而且第一步和第二步操作很可能出现类似的图谱。在提取过程中的重叠现象依赖于破碎细胞和组织所选用的物理过程的效率高低。

例如,在超声波破碎时,大肠杆菌可以在数秒内完全裂解,而结核杆菌则需要25min以上,所以在样品制备前需要摸清材料的基本特点。当前第88页\共有153页\编于星期六\10点蛋白质的分步提取法已被证实是一种快速有效的分级和浓缩不溶性蛋白质的方法。当前第89页\共有153页\编于星期六\10点(三)不同组织材料蛋白质常用提取方法1.植物组织的蛋白质提取一般是利用含有一定浓度的DTT(通常为0.2%)的缓冲液在具液态氮的研钵内研磨植物材料,然后离心,留上清液,并加入TCA/丙酮液沉淀蛋白质,最后用裂解液分解收集的蛋白质沉淀物。当前第90页\共有153页\编于星期六\10点优点:①克服了蛋白质在TCA/丙酮提取过程中可能发生的氧化作用,保持蛋白质在提取过程的还原状态。②可提高单位质量植物组织中蛋白质的提取量。③去除了植物次级代谢产物,如一些色素带来的影响。④纯化组织内蛋白酶活性。当前第91页\共有153页\编于星期六\10点缺点①会丢失一些蛋白质,②所沉淀的不一定全部是蛋白质,可能还包括一些植物组织的粗纤维,所以在裂解液分解后还要通过离心去除不溶的纤维组织。当前第92页\共有153页\编于星期六\10点称取新鲜叶或根2g左右

液氮研磨成细粉，分装入1.5mL离心管中

加入1mL左右蛋白提取液Ⅰ（含三氯乙酸和β-巯基乙醇的丙酮溶液）沉淀粗蛋白（-20℃1h）

在4℃下13000rpm离心20min

再加入相同体积蛋白提取液Ⅱ（含β-巯基乙醇的丙酮溶液）悬浮粗蛋白（-20℃1h）

在4℃下13000rpm离心20min

取沉淀，弃上清，重复用蛋白提取液Ⅱ悬浮清洗3次（-20℃1h）（主要去除盐离子和有机杂质如色素和多酚）

真空抽干（大约30-60min）得粗蛋白干粉（可贮于-20℃备用）当前第93页\共有153页\编于星期六\10点

粗蛋白干粉

用裂解液UTC溶解沉淀（25μl裂解液/mg沉淀），并在室温下放置1h（裂解期间不断涡旋5-6次/小时）

在20℃下13000rpm离心15min

取上清液，弃沉淀不溶物

蛋白含量测定

SDS

2-D电泳剩余部分贮存于-80℃备用当前第94页\共有153页\编于星期六\10点2.哺乳动物组织的蛋白质提取从动物组织中制备蛋白质提取物是比较简单的,因为动物细胞没有细胞壁,而且细胞膜非常脆弱,很容易被渗透压和机械力所破碎。通常是先进行组织洗涤,再利用匀浆器破碎,在缓冲液中离心,留上清液,加入沉淀试剂,离心，可得蛋白质。当前第95页\共有153页\编于星期六\10点一般用于双向电泳的样品蛋白质不需要考虑保留其生物活性,细胞可以在强变性条件下裂解。当前第96页\共有153页\编于星期六\10点如果用于免疫沉淀研究,则一定要选用温和的条件,确保蛋白质结构的完整性,如使用两性离子去污剂而不是离子型去污剂,低浓度而不是高浓度,单一去污剂而不是混合去污剂。当前第97页\共有153页\编于星期六\10点

如果在裂解过程中发现蛋白酶对目标蛋白有降解作用,则可考虑在低温下向提取的蛋白质或向裂解液中加入蛋白酶抑制剂。当前第98页\共有153页\编于星期六\10点

称取适量动物组织

液氮研磨成粉末状组织

将适量粉末转移至匀浆器，加入适量裂解液，进行匀浆

加50ug/mlRNase及200ug/mlDNase，在4℃放置15分钟。

15,000转，4℃离心60分钟（或40,000转，4℃离心30分钟）。收集上清分装样品，冻存于－70℃当前第99页\共有153页\编于星期六\10点匀浆缓冲液的成分主要有Tris-HCl(50mmol/L)10%甘油或蔗糖(0.25mol/L)EDTA(0-5mmol/L)NaCl(150mmol/L)DTT(0.5mmol/L)苯甲基磺酌氟(PMSF)(1.0mmol/L)。当前第100页\共有153页\编于星期六\10点首先利用韦林搅切器破碎动物组织器官,然后采用手动的或动力驱动的匀浆器在4°C的匀浆液中匀浆、过滤、清除脂类和黏蛋白。当前第101页\共有153页\编于星期六\10点3.细菌蛋白质的提取首先,在4℃下3000g离心15min收集细菌,然后用裂解缓冲液洗细胞,除去残留的培养基,离心收集洗过的细胞,留沉淀。每克细胞沉淀用约3mL裂解缓冲液重悬浮,4℃条件下搅动悬浮液30min,或用韦林搅切器低速混合悬浮液1min。加溶菌酶至浓度1g/L,并在4℃条件下孵育35min,温和振荡。按顺序加入NP-40(5g/L)、MgCl2(5mmol/L)、DNaseI(40μg/mL),搅动悬浮液30min,除去黏性的核酸。悬浮液在4℃条件下,23000g离心30min,沉淀用含有DTT的Laemmli缓冲液重悬浮,最后利用SDS分析可溶性蛋白组分和沉淀。。当前第102页\共有153页\编于星期六\10点细胞裂解过程中,DNA的释放经常导致提取物高度黏稠。除了用DNaseI处理外,也可以加入带正电荷的化合物,如鱼精蛋白硫酸盐或聚乙烯亚胺当前第103页\共有153页\编于星期六\10点细胞样品的一般处理步骤1)吸出培养液，用胰酶消化。2)加入PBS，1500ｇ离心10分钟，弃上清。重复3次。3)加入5倍体积裂解液，混匀（或在2×106细胞中，加入1ｍl裂解液）（或将1×106细胞悬于60～100ｕｌ裂解液中）。4)液氮中反复冻融3次。5)加50ug/mlRNase及200ug/mlDNase，在4℃放置15分钟。6)15,000转，4℃离心60分钟（或40,000转，4℃离心30分钟）。7)收集上清。8)分装样品，冻存于－70℃。当前第104页\共有153页\编于星期六\10点4.真菌蛋白质的提取将纯培养获得的真菌菌丝体用无菌水冲洗3次,过滤,沥干水分,置于-80℃超低温冰箱中冷冻。在液氮条件下研磨菌丝体,同时加入5倍样品量(mg/mL)的预冷(-20℃)蛋白样提取液(含有10%-30%TCA和0.07%-0.3%DTT的丙酮溶液),匀浆、涡旋5min左右,然后将提取物在-20℃条件下静置3h以上。在4℃下,15000-30000g离心20-30min,留沉淀。用含有0.07%-0.3%DTT的丙酮溶液淋洗3次。将获得的蛋白质在真空冷冻干燥机上冷冻成蛋白质干粉,-70℃超低温冰箱中保存备用。当前第105页\共有153页\编于星期六\10点5.花粉蛋白质组的提取将冷藏的花粉在预冷的研钵中研磨至粉末状,再用50mgEppendorf管分装,20℃保存备用。花粉粉末在冷冻条件下用磷酸缓冲液(pH7.6,含32.5mmol/LK2HP04,2.6mmol/LKH2Po4,400mmol/LNaCl)研磨50min,超声波处理5min.4℃下,12000g离心10min,15000g再离心10mino避开脂肪层,吸取上清液放入另一Eppendorf管中,沉淀中加入上述磷酸缓冲液,冰上研磨3min,超声波处理1min,4℃下15000g离心10min。避开脂肪层,吸取上清液,合并上清液,作为磷酸易溶性蛋白溶液备用。当前第106页\共有153页\编于星期六\10点沉淀中加入蛋白裂解缓冲液(8mol/L尿素,2mol/L硫服,4%CHAPS,20mmol/LTris碱,30mmol/LDTT,o.5%Bio-Lyte,pH3-10),冰上研磨25min,超声波处理3mino4℃下15000g离心10mino避开脂肪层,吸取上清液作为磷酸难溶性蛋白溶液。两类蛋白液合并,加入100%TCA使其终浓度达到10%,冰上静置10min。除去沉淀蛋白质中的盐分。将此混合液4℃,15000g离心10min,弃去上清液,沉淀中加入上述蛋白裂解缓冲液,冰上研磨10min,超声波处理3min,使混合液充分溶解,用2mol/LNaOH调溶液pH至近中性,制成蛋白质样品溶液,直接使用或是-70℃冷藏备用。当前第107页\共有153页\编于星期六\10点三、特殊蛋白质的分离(一)低丰度蛋白低丰度蛋白往往具有重要的功能。1.

增加样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量,但同时增加了高丰度蛋白的负荷,且造成蛋白质的叠加效应从而影响分离。

2.现常用预分级加窄pH胶的微制备技术进行低丰度蛋白的分离,即将总蛋白组分成蛋白质组亚群,再用pH梯度小于2个pH单位的IPG胶进行窄pH范围的分离,或设法事先去除高丰度蛋白当前第108页\共有153页\编于星期六\10点(二)强碱性蛋白先将蛋白质预处理以富集,再用特殊pH梯度的IPG胶条(如pH3~12、pH4~12或pH10~12)进行等电聚焦。其中窄范围碱性IPG胶(如pH10~12)需要克服反向、阴极向阳极、电渗流的影响。当前第109页\共有153页\编于星期六\10点(三)极端分子质量蛋白质

小于8kDa和大于200kDa的蛋白质在常规IPG-2D上不易看到,这可能是在Tris/glycine缓冲液中,样品和游离的烷基磺酸纳离子持续积累浓缩,与小分子质量的蛋白质发生对流混合,产生茸毛状的或模糊的带,从而降低小蛋白的分辨率;在胶底端,高浓度的十二磺酸使蛋白质固定和染色困难。对于极端分子质量蛋白质的分离,需要考虑采用其他蛋白质分离技术。当前第110页\共有153页\编于星期六\10点四、杂质种类及清除方法样品中非蛋白的不纯物质可能干扰蛋白质的分离及双向电泳图谱的质量,因此,在样品制备中需要清除这些杂质。一般来说,影响双向电泳的杂质包括小离子分子(盐离子、内源小分子、离子去污剂)、核酸、多糖、脂类、酚类及一些不溶物质。

当前第111页\共有153页\编于星期六\10点1.小离子分子双向电泳中存在的小离子分子可能来源于：1）研究材料本身,如组织中的代谢物和血清中的无机盐,2）在制备样品时被作为添加剂使用的成分,如缓冲液、无机盐、离子去污剂等。当前第112页\共有153页\编于星期六\10点这些物质可干扰等电聚焦，其方式有①盐离子可导致溶液的电导率增大,延长等电聚焦时间,直到离子移至胶条末端时聚焦才完成。②盐积聚在胶条内的阳极或阴极端，产生高传导性区域，使蛋白质不能在此处聚焦（如出现水平条纹），离子去污剂SDS与多肽形成复合物，干扰正常聚焦。当前第113页\共有153页\编于星期六\10点去盐可的方法1.采用透析、旋转透析、凝胶过滤和沉淀/重悬浮等方法,2.在初始步骤就采用低离子强度的洗涤溶液来解决,如Tris-山梨醇缓冲液。对于SDS的去除,可采用兼性离子去污剂或非离子去污剂的重泡胀溶液稀释含SDS的样品或加入丙酮并在高温下沉淀蛋白质。当前第114页\共有153页\编于星期六\10点2.核酸样品中DNA和RNA的存在(特别是高浓度的核酸)可导致IEF胶上的酸性区难以聚焦;如果对双向凝胶进行银染,核酸会产生高背景。而且,DNA的存在使样品黏性太高,阻滞凝胶孔径。如果分离的蛋白质通过银染检测,凝胶中的核酸也将染色,从而导致高背景。当前第115页\共有153页\编于星期六\10点清除核酸的方法:①使用DNase和RNaseA,但DNase和RNaseA也可能出现在双向电泳的图像中。目前已可用Benzanase解决这一不足,Benzanase是细菌的一种特异性内源DNA和RNA核酸酶,在8mal/L尿素存在时,可保持足够活性,且使用浓度可以很低,不会在双向凝胶中出现。②使用超速离心法除去大分子核。然而该方法也会除去高分子质量的蛋白质。③用高离子强度或高pH提取溶液减少核酸的干扰在应用低离子强度的提取溶液时,带负电荷的核酸很可能与带正电荷的蛋白质形成复合物,使用高离子强度提取或高pH的提取液提取,就可最大限度减少这些相互作用。当前第116页\共有153页\编于星期六\10点3.多糖多糖可以阻碍凝胶孔径,导致蛋白质沉淀,延长聚焦时间,有时也会出现水平条纹;某些多糖含有负电荷,能与蛋白质形成复合物。通常用硫酸铵或苯酚/乙酸的方法进行沉淀,随后离心;超速离心也可以除去高分子多糖。当前第117页\共有153页\编于星期六\10点4.脂类脂类和蛋白质形成复合物,减少蛋白质的溶解度。它们也可以和去污剂形成复合物,使得去污剂的效率降低。通过有机溶剂沉淀可从样品中除去多数脂类。采用强变性剂和去污剂可最大限度减少蛋白质与脂类的相互作用,但可能需要较多的去污剂。当前第118页\共有153页\编于星期六\10点5.酚类化合物许多植物组织中存在酚类化合物,可通过酶催化氧化反应将蛋白质修饰:①采用还原剂可阻止氧化反应的发生,在样品制备时加入DTT、DTE、亚硫酸盐或维生素C都可阻止氧化;②通过沉淀方法迅速从酚组分中分离蛋白质;③用抑制剂,如硫脲来灭活多酚氧化酶;④用聚乙烯吡咯烷酮吸收、清除酚组分。当前第119页\共有153页\编于星期六\10点6.不溶物质在样品中的不溶物质能阻碍凝胶孔径,并导致聚焦不良。采用杯上样法可阻碍不溶物质进入IPG胶条中。当前第120页\共有153页\编于星期六\10点实例1疏水蛋白质Molloy用氯仿、甲醇（有机溶剂）、硫脲，去污剂（表面活性剂）、三丁基膦化氢（还原剂）等溶剂提取出许多疏水蛋白质。质谱检测表明13种蛋白质中有9种在从前的双向电泳中从未出现过当前第121页\共有153页\编于星期六\10点实例2低丰度蛋白样品分级：降低样品复杂度，富集低拷贝蛋白；亚细胞分级，选择性沉淀，分级提取（蛋白质在一系列溶解能力逐渐增强的裂解液中溶解性能不同而实现）CibracanDye色谱技术浓缩用ProtoClear技术处理，人血浆中至少95%白蛋白和97%IgG被清除。当前第122页\共有153页\编于星期六\10点实例3极碱性蛋白浓缩：TCA/丙酮沉淀法，可以失活蛋白酶，减少蛋白降解，去除干扰物，富集极碱性蛋白，如从全细胞裂解液中富集核糖体蛋白样品处理提高电泳效果：碱性范围内凝胶基质不稳定，会产生逆向电渗透，除了可以用N,N’双甲基丙稀酰胺增加基质稳定性外，对等电点超过10的碱性蛋白质，通过1－10％的山梨醇梯度和16％的异丙醇减少不稳定性，提高电泳效果当前第123页\共有153页\编于星期六\10点第四节亚细胞器的分离与蛋白质提取蛋白质的大多数功能都是通过亚细胞器水平上实现的,通过亚细胞的功能就可以初步判断蛋白质的功能。由于细胞的区隔化作用,使每一个亚细胞器具有自己的一套蛋白质系统,这种蛋白质系统功能分布的特异性决定了细胞的功能。当前第124页\共有153页\编于星期六\10点要了解蛋白质的生物学功能,就需要知道其亚细胞定位和在受到外界剌激时从细胞的一个区室迁移到另一个区室的相关信息。共同协作执行同样生理功能,如参与代谢(代谢通路)、细胞信号转导(信号转导通路)、程序性死亡(凋亡)和细胞结构的维持(细胞骨架)等的蛋白质,应位于同一细胞区室。当前第125页\共有153页\编于星期六\10点由于细胞内蛋白质的数量是巨大的,而且细胞内的蛋白质补体是处于动态的,如果不先对细胞组分进行分离,就无法开展整个细胞蛋白质组的研究。因此有必要进行亚细胞分离技术的研究,以减少全细胞分析的复杂性。一旦获得亚细胞器后,便可进一步对其蛋白质进行分离和鉴定,研究其在细胞内不同生理状态下的表达情况。当前第126页\共有153页\编于星期六\10点一、亚细胞蛋白质组学的概念亚细胞蛋白质组学是针对细胞内不同区域结构功能单位的蛋白质组学进行研究。

当前第127页\共有153页\编于星期六\10点细胞内可分成不同细胞器或细胞区域,如细胞膜、线粒体等。另外,细胞内一些功能单位多是分子结构体或多蛋白复合体,如核基质、剪接体、纺锤体、核孔结构及核糖体等。

这些细胞器、多蛋白组成的功能单位的区域化分布和聚集方式决定该细胞的功能是亚细胞蛋白质组学研究的主要对象。当前第128页\共有153页\编于星期六\10点研究亚细胞蛋白质组学的意义在于:①可以富集低丰度的蛋白质,完善全细胞蛋白质组;②提供蛋白质的亚细胞定位信息;③加深对亚细胞组分的结构功能理解;④加深对细胞生理分子机制的理解;⑤研究亚细胞蛋白质组的差异表达谱。当前第129页\共有153页\编于星期六\10点亚细胞分离过程概括起来有两个主要步骤:1.组织匀浆，在适当条件下破碎细胞2.细胞器分离，以不同方法将不同细胞器进行分级分离。二、亚细胞器分离的技术基础当前第130页\共有153页\编于星期六\10点匀浆的目标是:①用可重复的方法获得最大限度的细胞裂解;②所使用的破坏力对目标细胞器伤害最小;③保留目标细胞器的结构和功能的完整性当前第131页\共有153页\编于星期六\10点超速离心法是分离和提取生物大分子及亚细胞单位结构的重要手段之一,这主要是利用细胞内各种颗粒大小、形状和密度不同,在不同离心力场下进行差速离心或不同密度梯度离心,从而获得不同亚细胞组分。当前第132页\共有153页\编于星期六\10点尽管分离亚细胞组分的目标应是最大限度地减少对所分离细胞组分的破坏,然而实际上目前的分离技术根本无法达到即在自然状态下分离,同时又不破坏细胞器的要求。目前也没有任何一种分离组织的方法可以适用于所有的组织,适用于某一组织的亚细胞的分离方法并不一定就适合于分离另一组织的细胞器。当前第133页\共有153页\编于星期六\10点(一)亚细胞器及其蛋白质分离常用技术1.细胞的破碎方法破碎培养细胞或者破碎组织细胞可以采用渗透压冲击、超声波震荡、机械研磨等各种方法。整个过程可以通过显微镜实现监控以确保细胞器结构上的完整。当前第134页\共有153页\编于星期六\10点2.差速离心与密度梯度离心法匀浆产生的细胞裂解物通常通过一系列差速离心步骤和一个密度梯度来分离细胞器和粒子。一般来说,先进行差速离心得到沉淀,然后再在密度梯度中进行超速离心,这种逐渐加大离心力的顺序离心及密度梯度离心的选择将分别根据细胞成分的大小和密度来分离。当前第135页\共有153页\编于星期六\10点3.免疫共沉淀法信号复合体一般不能通过密度梯度离心纯化,而免疫共沉淀是一个比较理想的方法,将目标信号分子蛋白从细胞或亚细胞组分中沉淀后,供质谱技术鉴定和基因功能分析。当前第136页\共有153页\编于星期六\10点4.亲和层析法选择一定的配体或配基,可将细胞或亚细胞内不同亲和特异性的蛋白质组分逐一分离出来并继以蛋白质组学研究。当前第137页\共有153页\编于星期六\10点(二)亚细胞器的分离及蛋白质提取1.线粒体线粒体在亚细胞蛋白质组学研究中占有重要的地位,它是细胞内含量最丰富的细胞器,由一个双层膜系统组成,外膜与内膜隔开并包围着内膜,在内膜的内侧为基质。线粒体具有能量转换、物质运输、调节离子平衡、信息传递和合成腺昔三磷酸等功能。在动物发生疾病或植物发生病害后,线粒体的呼吸相关酶系均要发生变化,而且线粒体已发现是某些植物病原菌毒素的作用位点。因此,分离线粒体蛋白