细胞培养基培训资料比较全面,可以有个初步了解

企业优势标准化的生产管理我们对每批产品都进行严格的质量控制，做到每批产品都有可追溯性.采用先进的生产设备和标准化的操作程序，保证产品的质量的稳定性，降低产品的批间差.定期超纯水及细胞培养注射用水水质的监测严格的在线管道清洗（CIP)及消毒程序(SIP)标准化的配液，过滤，分装体系当前第1页\共有101页\编于星期四\21点细胞学简介什么是细胞？能进行独立繁殖的有膜包围的生物体的基本结构和功能单位。一般由质膜、细胞质和核（或拟核）构成，是生命活动的基本单位。当前第2页\共有101页\编于星期四\21点维持细胞体外生存的必要条件严格的无菌无毒环境体外培养的细胞缺乏对微生物和有毒物质的防御能力适合的营养条件高质量的细胞培养基和血清是细胞培养成功的基本条件适宜的生存环境恒定适宜的温度、pH值、气相环境（二氧化碳的浓度）当前第3页\共有101页\编于星期四\21点细胞培养相关设备CO2培养箱细菌霉菌培养箱过滤设备烘箱高压灭菌设备水浴锅磁力搅拌器离心机

酸缸液氮罐

精密天平倒置显微镜

pH计酶标仪

电导率仪渗透压仪

细胞计数板超净台培养皿等相关耗材生物安全柜当前第4页\共有101页\编于星期四\21点细胞培养流程贴壁细胞培养流程当前第5页\共有101页\编于星期四\21点细胞培养流程

悬浮细胞培养流程当前第6页\共有101页\编于星期四\21点细胞培养基组要成分①基本培养基②血清③细胞培养试剂（抗生素细胞解离，生长因子等）④平衡盐溶液当前第7页\共有101页\编于星期四\21点培养基必须的基础营养物质水超纯水、细胞培养注射用水（本公司所采用的为细胞培养注射

用水）氨基酸必需氨基酸：组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸。

条件性必需氨基酸：谷氨酰胺、精氨酸、半胱氨酸、酪氨酸非必需氨基酸：丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、甘氨酸、脯氨

酸、丝氨酸。维生素生物合成的辅助因子，机体自身不能合成：如生物素、叶酸、核黄素、

维生素B12。血清

提供额外的营养以及提供生长、附着因子pH指示剂

可使细胞产生类似于苛尔蒙的反应，在做苛尔蒙的研究或者生产中应去

掉酚红指示剂，避免产生干扰。当前第8页\共有101页\编于星期四\21点经典培养基的应用BME(BasalMediumEagle):

是由Eagle发明的，是最简单的培养基，只有11种氨基酸和盐及一些维生素。最先用于培养小鼠的L细胞和人类HeLa细胞，现在广泛用于各种细胞的培养EMEMorMEM(Eagle’sMinimumEssentialMedium):

是BME的升级版，氨基酸浓度是BME的两倍，适用于更多的细胞当前第9页\共有101页\编于星期四\21点经典培养基应用DMEM(Dulbecco’sModificationofEagle’sMedium)

是Dulbecco改进的MEM.氨基酸和维生素浓度是BME的4倍.最先葡萄糖的浓度是1g/L，称为低糖DMEM,后来增加到4.5g/L，称为高糖DMEM，广泛用于各种细胞培养。当前第10页\共有101页\编于星期四\21点经典培养基应用M199(Medium199):

是一种比较古老的，配方复杂的，含有核苷酸，核酸等成分的培养基。最初用于鸡胚肌细胞的培养，还用于各种细胞的维持和病毒生产当前第11页\共有101页\编于星期四\21点经典培养基应用RPMI1640(RoswellParkMemorialInstitute#1640):

是McCoy’s5A的改进版，含有高浓度的肌醇。广泛用于悬浮细胞的培养。如人类白细胞，骨髓瘤细胞，杂交瘤细胞等血液来源的细胞当前第12页\共有101页\编于星期四\21点经典细胞培养基应用Ham’sF10(Ham’sNutrientMixtureF10):

由Ham发明，用于人类2倍体细胞和仓鼠细胞的培养。Ham’sF12(Ham’sNutrientMixtureF12):F10的升级版，含有更多的维生素，肌醇，氨基酸。用于培养大鼠，兔子和鸡胚细胞，还用于中国仓鼠卵巢细胞以及肺细胞的培养当前第13页\共有101页\编于星期四\21点经典细胞培养基的应用IMDM

是由Iscove改良的Dulbecco培养基，较DMEM增加了几种非必需氨基酸和一些维生素，IMDM为高葡萄型培养基，可用于杂交瘤细胞的筛选培养，也可作为无血清培养的基础培养基当前第14页\共有101页\编于星期四\21点经典细胞培养基应用DMEM/F12

是DMEM和F12按1:1比例配制而成，是神经生物学最常用的基本培养基，也是无血清培养基的基础液，IMDM非常适合于迅速增殖，高密度细胞的培养，包括Jurkat细胞，COS-7，和巨噬细胞。IMDM支持小鼠B淋巴细胞，来自骨髓的造血组织，脂多糖刺激的B细胞，T淋巴细胞，和各种杂交细胞的生长。与血清一起使用时，它支持多种哺乳动物细胞，包括骨髓，杂交瘤细胞和淋巴细胞的生长.当前第15页\共有101页\编于星期四\21点经典细胞培养基应用McCoy5A

是McCoy等人在1959年研制，是一种专门为培养肉瘤细胞研制的培养基，除适用于原代细胞、组织活检细胞和淋巴细胞培养外，还适用于较难培养的细胞，如皮肤，牙龈，睾丸，小鼠肾脏，大网膜，肾上腺，肺，脾，大鼠胚胎和其他组织的原代生长，以及活体组织的体外移植。当前第16页\共有101页\编于星期四\21点经典培养基用途汇总MEM:仅含12种必须氨基酸，谷氨酰胺和8种维生素广泛应用于细胞系的培养，是DMEM的前身。BME：删除了一些必须氨基酸，增添了一些非必须氨基酸。DMEM:2xMEM的成分，有高糖、低糖之分，广泛用于哺乳细胞的培养。RPMI1640:最初针对淋巴细胞的培养而设计M199:广泛用于病毒学，疫苗生产和组织移植培养。Ham'sFmixs：可在血清含量较少的情况下培养细胞。当前第17页\共有101页\编于星期四\21点细胞培养基形式（按外观）即用型(1X)液体培养基:直接用培养基浓缩液(10Xor50X):用前需要稀释成1×

干粉培养基DPM(DryPowderMedia):

需要在水中溶解,加入碳酸氢钠,调pH值,然后过滤才可以使用.

高级颗粒技术培养基AGT(AdvancedGranulationTechnologyTM):

比DPM形式的培养基更容易溶解的颗粒状的培养基.

AGT是完全为工业产量的用户开发的,pH提前调好，所有的成分都提前混合好,只需要加水溶解和过滤。当前第18页\共有101页\编于星期四\21点干粉培养基与液体即用型培养基对比当前第19页\共有101页\编于星期四\21点细胞培养基类型（按成分）传统培养基要添加血清(5-10%)的培养基高级培养基（Advancedmedium）浓缩了营养物质和其他成分的培养基,只需要<2%的血清(减少50-90%)无血清培养基(无血清培养基/无蛋白培养基/化学定义的培养基)使用时无须再添加血清,主要用于生物产品生产,干细胞研究等当前第20页\共有101页\编于星期四\21点专用培养基针对角质细胞、淋巴细胞、造血细胞、内皮细胞、肝细胞、神经元细胞、胚胎干细胞、CHO细胞、293细胞、各类昆虫细胞、杂交瘤细胞、羊水细胞等的无血清培养基当前第21页\共有101页\编于星期四\21点（SFM,PFM和CDM培养基）的区别Serum-FreeMedium（SFM）成分更加清晰消除因血清批次不同而带来的不确定性–保持实验的连续性易于纯化和下游处理优化特殊细胞及其功能的培养条件越来越多的无血清培养基用非动物/人来源的原料制造有利于精确阐述细胞功能提高生产力更好控制生理反应专门针对角质细胞、淋巴细胞、造血细胞、内皮细胞、肝细胞、神经元细胞、胚胎干细胞、CHO细胞、293细胞、各类昆虫细胞、杂交瘤细胞、羊水细胞的无血清培养基无需加入血清可能包含降解的蛋白或者蛋白块蛋白含量保持在易于纯化的最小状态优化特殊细胞培养条件当前第22页\共有101页\编于星期四\21点Protein-FreeMedia(PFM)

无蛋白(不同的厂商有不同的说明)包含起源于动物或者植物的不明确的提取物Chemically-DefinedMedia(CDM)

无蛋白和不明确的成分所有的成分都有一个明确的结构，可以提供性能一致的产品,减少批次间的差别当前第23页\共有101页\编于星期四\21点培养基的保存与运输干粉：24个月，2～8℃避光保存，可在室温情况下运输.液体：12个月，所有的培养基都必须在2～8℃，避光保存，不能冷冻.当前第24页\共有101页\编于星期四\21点血清产品简介

血清－血清的作用提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。（如氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核算衍生物、胰岛素、肾上腺皮质激素、类固醇激素、纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、血小板生长因子等）提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调变它们所结合的物质活力。有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。起酸碱度缓冲液作用。提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余胰蛋白酶失活，保护细胞不受伤害。当前第25页\共有101页\编于星期四\21点动物血清的种类.胎牛血清(FBS):fetalbovineserum直接胚胎心脏取血，胎牛还未接触外界，血清中所含的抗体、补体等对细胞有害的成分最少。.新生牛血清(NBS):newborncalfserumornewbovineserum

出生小于于十四天.小牛血清（CS)：calfserum

出生小于一年.捐献血清:特殊饲养的，专门用来进行血清提取的牛.其他血清:

horse,chicken,goat,lamb（羊）,porcine（猪）,rabbit当前第26页\共有101页\编于星期四\21点血清的缺点

1、对大多数细胞，在体内状态，血清不是它们接触的生理学液体，只是在损伤愈合以及血液凝固过程中才接触血清，因此使用血清有可能改变某种细胞在体内的正常状态，血清可能促进某些细胞的生长（成纤维细胞）同时抑制另一类细胞生长（表皮细胞）。

2、血清含有对细胞产生毒性的物质，如多胺氧化酶，能与来自高度繁殖细胞的多胺反应（如精胺、亚精胺）形成有细胞毒性作用的聚精胺。补体、抗体、细菌毒素等都会影响细胞生长，甚至造成细胞死亡。

3、动物个体不同，血清产地、批号不同，每批质量差异甚大，其成分不能保持一致。

4、取材中可能带入支原体、病毒，对细胞产生潜在影响，可能导致实验失败或实验结果不可靠性。

5、血清的使用使得实验和生产的标准化困难，其中的蛋白质使得某些转基因蛋白生物药品生产中分离纯化工作很难完成。大规模生产中，血清来源越来越困难，价格昂贵，是构成动物细胞培养对生产成本的主要部分之一。

当前第27页\共有101页\编于星期四\21点细胞培养基相关试剂平衡盐及缓冲液细胞消化试剂pH调节试剂营养添加剂抗生素细胞冻存液当前第28页\共有101页\编于星期四\21点平衡盐及缓冲溶液PBSPBS是生物学研究和组织培养中常用的一种缓冲溶液。例如，细胞或组织的运输，细胞计数时的稀释，溶液的配制，容器，包括细胞的清洗等，但不能用于细胞及组织块的消化。DPBS配方中无钙镁离子，不会中和胰酶及EDTA活性，用于贴壁和团块细胞的消化解离，细胞解离前的清洗。当前第29页\共有101页\编于星期四\21点HBSSHBSS可用于多种细胞培养应用，如细胞解离前的清洗，细胞或组织的运输，细胞计数时的稀释，溶液的配制等。含钙和镁的HBSS配方一般用作运输培养基或试剂配制，无钙镁的HBSS用于细胞解离前的清洗，不会降低胰酶的活性当前第30页\共有101页\编于星期四\21点细胞消化试剂0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA

胰蛋白酶是一种胰腺丝氨酸蛋白酶，具有底物特异性，解离消化作用强，被用于组织培养中贴壁细胞的传代。但细胞培养环境中存在的二价阳离子，如钙和镁等可以抑制解离。EDTA可螯合二价离子，从而增强胰蛋白酶的作用。当前第31页\共有101页\编于星期四\21点影响胰酶消化细胞的因素胰蛋白酶溶液的消化能力是和溶液的pH、温度、胰酶浓度及溶液中是否含有Ca2+、Mg2+离子和血清等因素有关。通常情况下，pH8.0,温度37℃其作用能力最强。另外，钙、镁离子及血清均能大大降低其消化能力。我们每次进行传代消化前，一定要用D-Hanks液或PBS液反复冲洗细胞培养瓶，以便于将含血清的培养基冲洗干净，这样就能大大提高消化液的消化能力。当前第32页\共有101页\编于星期四\21点台盼蓝试剂台盼蓝染色是一种广为接受的用于死细胞染色法。台盼蓝被正常的活细胞排斥而能被丧失活性的细胞吸收，并呈现蓝色。

当前第33页\共有101页\编于星期四\21点pH调节试剂NaHCO3（7.5%）碳酸氢钠是常用的缓冲体系的一部分，用来维持培养环境中生理pH值之间,大多数细胞适宜在条件下生长，为了维持培养环境的Ph，多采用在培养基中加入碳酸盐等缓冲剂的方法，细胞生长过程中，随细胞数量的增多和代谢活动的加强，不断产生CO2，溶解的CO2与HCO3-达到平衡，从而使培养基的pH降低，在溶液中存在如下反应：H2O+CO2←→H2CO3←→H++HCO3-抵消二氧化碳产生的作用可通过增加碳酸盐的浓度来解决：NaHCO3←→Na++HCO3-HCO3-的增加可使H2O+CO2←→H2CO3←→H++HCO3-的反应向左边进行直至pH在7.4左右达到平衡。当前第34页\共有101页\编于星期四\21点Hepes（1M)

HepesBuffer是用于细胞培养基中的一种生物缓冲剂，在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的pH值，Hepes(25mM)可以作为碳酸氢盐缓冲液的替代品，或者作为碳酸氢盐缓冲液的添加物（10-15mM），以解除需要高浓度CO2培养环境的限制.当前第35页\共有101页\编于星期四\21点几种平衡盐系统中NaHCO3、Hepes、CO2的用量

当前第36页\共有101页\编于星期四\21点细胞培养基营养添加剂BSA（V）（7.5%）牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin,BSA）是牛血清中的一种球蛋白，又称第五组分（需要注意的是，第五组分并不是BSA的一种组份，而是EdwinJ.Cohn教授早期从血液中通过特定的分离技术得到5种组份，其中第五种就是白蛋白），CAS号为9048-46-8，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430kDa，等电点为4.7。牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在westernblot中作为封闭试剂。血液中的白蛋白主要起维持渗透压作用、PH缓冲作用、载体作用和营养作用。在动物细胞无血清培养中，添加白蛋白可起到生理和机械保护作用和载体作用。当前第37页\共有101页\编于星期四\21点牛血清白蛋白提取工艺当前第38页\共有101页\编于星期四\21点牛血清白蛋白在细胞培养中的应用以流感病毒为例作为流感病毒分离培养液的营养添加剂替代牛血清添加牛血清白蛋白生长添加剂不会影响TPCK-胰酶促转染的效率，保持了TPCK-胰酶的活性，促进病毒的复制，同时对后期的血凝及血凝试验不会产生干扰，人和动物血清中存在非特异性血凝抑制素，它们是游离在血清中类似病毒受体的唾液酸残基，能与病毒血凝素分子上的受体结合，会竞争抑制病毒与红血球的结合，因而造成假阳性，因此HI试验必须用受体破坏酶处理血清。

当前第39页\共有101页\编于星期四\21点牛血清白蛋白使用注意事项牛血清白蛋白（7.5%）保存于2-8℃，避免与强氧化剂及强酸接触。在流感病毒分离培养时,牛血清白蛋白（7.5%）用量为每500ml细胞培养基添加

12.5ml，终浓度0.2%。当前第40页\共有101页\编于星期四\21点抗生素产品青链霉素庆大霉素两性霉素B庆大霉素、两性霉素B青链霉素、两性霉素B当前第41页\共有101页\编于星期四\21点青链霉素青霉素（10000U/ml）链霉素（10000ug/ml）青链霉素是广谱抑菌剂，对革兰氏阴性和阳性微生物有抗菌性，青霉素影响细菌细胞壁合成的终止步骤，在转肽反应步骤抑制多肽链的延伸，青链霉素的有效浓度为100u/ml；链霉素为100ug/ml1ml青链霉素试剂可添加100ml细胞培养基中使用保存条件：-20℃冷冻保存，避免反复冻融当前第42页\共有101页\编于星期四\21点庆大霉素庆大霉素（0.5mg/ml）or（50mg/ml）庆大霉素是一种广谱细菌培养抗生素，在抗菌浓度下，它对病毒和哺乳细胞没有毒性，对革兰氏阳性和阴性细菌以及支原体有抗菌活性，被用于长期病毒和组织培养研究。主要是通过与50S核糖体亚基的L6蛋白结合，干扰细菌蛋白质合成，它的有效浓度是5ug/ml，在大于300ug/ml时具备细胞毒性。每ml庆大霉素试剂添加100ml细胞培养基中使用保存条件：15-30℃当前第43页\共有101页\编于星期四\21点两性霉素B两性霉素B(250ug/ml）两性霉素B溶液是一种对真菌有抗菌活性的抗生素。将其作为一种抗真菌、抗酵母菌以及抗霉菌制剂使用，它通过与固醇结合、干扰敏感真菌的细胞膜渗透性。通常的有效浓度是2.5ug/ml。每ml两性霉素B试剂可添加100ml细胞培养基产品。保存条件：-20℃，避光保存，避免反复冻融

当前第44页\共有101页\编于星期四\21点庆大霉素、两性霉素B庆大霉素（0.5mg/ml）、两性霉素B（250ug/ml）庆大霉素/两性霉素B溶液针对革兰氏阴性和阳性菌以及真菌和酵母菌具备广谱抗菌活性，它常被作为抗真菌、抗酵母菌、抗霉菌或抗细菌制剂。每ml庆大霉素、两性霉素B试剂可添加100ml细胞培养基中使用保存条件：-20℃避免反复冻融，避光保存当前第45页\共有101页\编于星期四\21点青链霉素、两性霉素B青霉素（10000u/ml）链霉素（10000ug/ml）两性霉素B(25ug/ml）青霉素/链霉素/两性霉素B针对革兰氏阴性和阳性菌以及真菌和酵母菌具备广谱抗菌活性，它常被作为抗真菌、抗酵母菌、抗霉菌或抗细菌制剂。每ml青链霉素、两性霉素B可添加于100ml细胞培养基中使用保存条件：-20℃，避光保存，避免反复冻融当前第46页\共有101页\编于星期四\21点关于抗生素使用的建议由于细菌和酵母等的污染很容易观察到，污染细胞的及时清理就大大减少了支原体、病毒的污染机会。潜在的支原体、病毒的污染会带来很大的危害。这些微生物的存在会影响细胞的理化性质，从而使研究者得到错误的实验结果。在严重的情况下，甚至使一个实验室数年的研究白白浪费。由于过滤技术的提高和超净台质量的改进，在规范的细胞培养操作过程中引进污染的机会已经被大大降低了。所以比较合理的建议是，在常规的细胞培养中不要使用抗生素。只有在培养污染源很多（比如组织培养），或者培养非常珍贵的细胞株时才使用抗生素。当前第47页\共有101页\编于星期四\21点细胞冻存液细胞冻存液由相应培养基、特级胎牛血清和细胞培养级DMSO（二甲基亚砜）组成，经过改良和优化，产品含符合细胞冻存的独特配方，保护细胞免收冰晶河溶质损伤，能有效地提高复苏细胞存活率和活力，助科研工作者摆脱程式繁琐、操作复杂、微生物污染可能性高的冻存调配工作，专注于下游的研究。保存条件：-20℃，避免反复冻融当前第48页\共有101页\编于星期四\21点细胞冻存程序选择指数生长期的细胞1000r/min5分钟离心去上清，（贴壁细胞消化后离心，悬浮细胞直接离心）弃上清，用细胞冻存液混悬沉淀细胞，将细胞悬液浓度调整到106-107个/ml分装于冻存管中进行程序降温：4℃30min，-20℃30-60min，-80℃超低温冰箱过夜后转移到液氮罐内，长期冻存。当前第49页\共有101页\编于星期四\21点细胞冻存的注意事项注意事项冻存前确认细胞未被污染，分析细胞系的可靠性。选择合适的冷冻速度和冷冻温度，以免在冻存过程中损伤细胞常温条件下DMSO对细胞有毒副作用，故应将冻存液在4℃条件下放置40-60min后使用。冻存管放入液氮罐时，小心液氮溅出。

当前第50页\共有101页\编于星期四\21点细胞复苏程序当前第51页\共有101页\编于星期四\21点

如何选择培养基当前第52页\共有101页\编于星期四\21点

YOCON细胞培养基当前第53页\共有101页\编于星期四\21点当前第54页\共有101页\编于星期四\21点当前第55页\共有101页\编于星期四\21点当前第56页\共有101页\编于星期四\21点当前第57页\共有101页\编于星期四\21点当前第58页\共有101页\编于星期四\21点细胞或细胞系常用的培养基当前第59页\共有101页\编于星期四\21点细胞或细胞系常用培养基当前第60页\共有101页\编于星期四\21点

YOCON细胞培养基生产工艺当前第61页\共有101页\编于星期四\21点细胞培养基产品在流感病毒分离上的应用流感病毒分离所需培养基及试剂DMEM(高糖，含L-谷氨酰胺，不含丙酮酸钠）胎牛血清0.05%胰酶+0.02%EDTA青链霉素（10000u/ml，10000ug/ml）庆大霉素（50mg/ml）Hepes（1M）BSA(v)7.5%TPCK-胰酶（2mg/ml）HBSS

当前第62页\共有101页\编于星期四\21点相关试剂用量当前第63页\共有101页\编于星期四\21点病毒CPE反应当前第64页\共有101页\编于星期四\21点病毒液的收获当75%～100%细胞出现病变时进行收获，收获之前可以将细胞放于-70℃冰箱，冻融1～2次，以提高收获标本的病毒滴度。即使无细胞病变也应该于接种后第7天收获。收获病毒液时，先温和摇动细胞瓶数次，然后用10mL的无菌移液管吸取病毒液置于15mL无菌离心管中，混匀病毒。收获的病毒液可以进行红细胞凝集实验，如没有红细胞凝集现象，应将收获病毒培养液再MDCK细胞传代2-3次。如果有必要，可再通过血凝抑制实验鉴定分离物，并将分离物保存在-70℃或-70℃以下。当前第65页\共有101页\编于星期四\21点质控及检测能力先进的检测仪器标准的检测操作流程每个批产品的监测和留样符合GMP标准的检测环境当前第66页\共有101页\编于星期四\21点产品相关质控方法出处pH依据中华人民共和国药典2010年版二部附录VIHpH测定法.无菌依据中华人民共和国药典2010年版二部附录XIH无菌检查（2）直接接种法，进行细菌真菌的检测。内毒素依据中华人民共和国药典2010年版二部附录XIE细菌内毒素检查法中凝胶半定量法，利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生的细菌内毒素。支原体检测依据中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅫB支原体检查法中培养法当前第67页\共有101页\编于星期四\21点SP2/0毒性检测依据《中国生物制品主要原辅料质控标准》中SP2/0生长曲线，倍增时间的测定渗透压依据中华人民共和国药典2010年版二部附录IXG渗透压摩尔浓度测定法中（1）测量溶液的冰点下降来间接测定其渗透压摩尔浓度。凝胶电泳图谱依据中华人民共和国药典2010年版三部附录F电泳法第四法聚丙烯酰胺凝胶电泳法。蛋白总量依据中华人民共和国药典2010年版二部附录ⅦM蛋白质含量测定法第五法（考马斯亮蓝法Bradford）当前第68页\共有101页\编于星期四\21点为达到质控标准采取的措施当前第69页\共有101页\编于星期四\21点细胞培养基类产品质控项目当前第70页\共有101页\编于星期四\21点培养基质控项目当前第71页\共有101页\编于星期四\21点培养基质控项目当前第72页\共有101页\编于星期四\21点抗生素产品质控项目当前第73页\共有101页\编于星期四\21点缓冲液类产品当前第74页\共有101页\编于星期四\21点其他试剂质控项目当前第75页\共有101页\编于星期四\21点其他试剂质控标准当前第76页\共有101页\编于星期四\21点细胞培养基产品使用常见问题汇总Hank's平衡盐溶液(HBSS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's平衡盐溶液(HBSS)和Earle's平衡盐溶液(EBSS)有什么本质的功能差别？

HBSS和EBSS的主要差别在于碳酸氢钠的水平,Eagles(2.2g/L)中比在Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。当前第77页\共有101页\编于星期四\21点为何培养基保存于4°C冰箱中，颜色会偏暗红色，且pH值会越来越偏碱性？培养基保存于4°C冰箱中，培养基内之CO2会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenolred)的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可以通入无菌过滤之CO2，以调整pH值。

当前第78页\共有101页\编于星期四\21点L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？

L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。当前第79页\共有101页\编于星期四\21点什么情况下要求培养基中不能含有酚红？酚红在培养基中用作批H值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。当前第80页\共有101页\编于星期四\21点如何用台盼兰计数活细胞？

用无血清培养基把细胞悬液稀释到200～2000个/毫升，在0.1毫升细胞悬液中加0.1

毫升0.4％的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后，用血球计数板计数细胞。活细胞排斥台盼兰，因而染成蓝色细胞是死细胞。当前第81页\共有101页\编于星期四\21点钙镁离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？钙镁离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子.

当前第82页\共有101页\编于星期四\21点购买的细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？

研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于–80°C太久。

当前第83页\共有101页\编于星期四\21点为什么大多数细胞培养基中要含有丙酮酸钠？丙酮酸钠作为细胞培养的一种能源物质。它往往被加到低葡萄糖组分的培养基中（1.0g/L葡萄糖），也有时添加到较高的葡萄糖配方中（4.5g/L)。提供细胞生长所需要的碳源，在没有葡萄糖时，细胞可代谢丙酮酸钠产生丙酮酸进行能量合成。当前第84页\共有101页\编于星期四\21点培养细胞生长减慢的原因有哪些？其解决办法有哪些？

答：可能得原因有：更换了不同的培养液或血清；培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子等耗尽或缺乏或已被破坏；培养物中有少量细菌或真菌污染；试剂保存不当；比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验找出可能的原因。解决办法：增加起始培养细胞浓度；让细胞逐渐适应新培养液；换入新鲜配制培养液；补加谷氨酰胺或生长因子等；用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物，或用抗生素除菌；血清需保存在-5℃到-20℃；培养液需在2－8℃避光保存；含血清完全培养液在2-8℃保存，并在2周内用完；分离培养物，检测支原体。当前第85页\共有101页\编于星期四\21点细胞培养基偶然被冻，可否继续使用？答：如果细胞培养基偶然被冻，您应该自然溶解培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。严格意义上要避免细胞培养基冷冻，会影响细胞培养。当前第86页\共有101页\编于星期四\21点HEPES在细胞培养过程中起什么作用？HEPES溶液：是一种弱酸，中文名字是羟乙基哌秦乙硫磺酸，主要作用是防止培养基pH迅速变化。在开放式培养条件下，培养基脱离了5%CO2的环境，CO2气体迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此时可以维持pH7.0左右。一般在进行克隆化培养时要添加HEPES。当前第87页\共有101页\编于星期四\21点血清使用时一定需要灭活么？实验显示，经过正确处理的热灭活血清对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有作用，甚至因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。若非必须，可以不需要做热处理这一步。不但节省时间，更确保血清的质量。当前第88页\共有101页\编于星期四\21点培养液pH下降很快可能原因有哪些？其解决办法是什么？通常细胞生长得非常快时，pH值通常下降得很快。此时可以及时传代、提高传代比例或降低血清量等方法进行解决。此外，培养瓶盖拧得太紧、NaHCO3

缓冲系统缓冲能力不够、培养液中盐浓度不正确、细菌、酵母或真菌污染等也能导致pH值通常下降得很快。（1）按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度，2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5％到10％。（2）改用不依赖CO2培养液。（3）松开瓶盖1/4圈。加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。（4）在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液，在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。（5）如果是污染造成的则丢弃培养物或用抗生素除菌。当前第89页\共有101页\编于星期四\21点无血清培养基消化贴壁细胞时，用什么终止消化试剂反应？

通常用无血清培养基进行贴壁细胞传代时，可添加商品化的蛋白酶抑制剂或含有钙镁离子的商品化试剂进行终止反应。当前第90页\共有101页\编于星期四\21点怎样对病毒分离用的鼻咽拭子样本进行处理？

WHO规定用力将含有鼻咽拭子的采样管置于漩涡振荡器中进行混合振荡，振荡后将鼻咽拭子贴紧采样管内壁进行挤压，将拭子含有的病毒采样液全部挤压到采样管中，取出拭子，每ml采样液中添加庆大霉素试剂（50mg/ml）0.2ml，室温下放置15min，1000rpm，离心5min，取上清液200ul进行接种，其余上清液-80℃冻存。当前第91页\共有101页\编于星期四\21点流感病毒阳性分离率低的原因？

采样方法及部位（咽部后壁,用力采集）采集拭子（高采集率及高释放率）采样液（恒定的pH值，渗透压，稳定剂）运送温度（4℃）样本处理（污染物，保存温度）转染率（转染到宿主细胞的数量）转染的细胞状态（MDCK细胞状态差）病毒生长液（病毒生长液配制问题）当前第92页\共有101页\编于星期四\21点为什么分离普通流感病毒在细胞培养法中需添加TPCK-胰酶，而鸡胚法不需要添加？维持液中加适量胰酶的目的是为了提高流感病毒在细胞中的复制能力。绝大多数流感病毒只有血凝素（H）是裂解型的才具有感染性。细胞培养不像鸡胚，它的维持液中不含有蛋白水解酶，无法将病毒粒非裂解型的HA0变成裂解型的HA1+HA2。故必须在维持液中加入适量的胰酶。当前第93页\共有101页\编于星期四\21点细胞相关产品的英文名称DMEM(Dulbecco'sModifiedEagleMedium)MEM(MinimumEssentialMedia)RPMI1640(RoswellParkMemorialInstitute1640)DMEM/F12(Dulbecco'sModifiedEagleMedium⁄Ham’sF12)当前第94页\共有101页\编于星期四\21点F10(Ham’sF10NutrientMixture)F12(Ham’sF12NutrientMixture)IMDM(Iscove’sModifiedDulbecco’sMedium)McCoy's5A(McCoy's5A)M199(Medium199)HBSS(Hanks'BalancedSaltSolution)当前第95页\共有101页\编于星期四\21点EBSS(Earle'sBalancedSaltSolution)PBS(PhosphateBufferedSaline)DPBS(Dulbecco'sPhosphateBufferedSaline)TrpsinwithEDTA(胰酶+EDTA)Trypanbluesolution(台盼兰溶液）Hepesbuffer（Hepes缓冲液）当前第96页\共有101页\编于星期四\21点SodiumBicarbonateSolution（碳酸氢钠）CellCultureFreezingMedium（细胞冻存液）BSA(V)(BovineSerumAlbuminfractionV)Penicillin-Streptomycin(青链霉素）当前第97页\共有101页\编于星期四\21点AmphotericinB（两性霉素B)Penicillin-Streptomycin-AmphotericinB(青链霉素、两性霉素B)Gentamicin-AmphotericinB(庆大霉素、两性霉素B）Gentamicin（庆大霉素）Waterforinjection(cellculture)（细胞培养级注射用水）当前第98页\共有101页\编于星期四\21点常见细胞系序号细胞系细胞类型种组织培养基1293成纤维细胞人胚胎肾MEM，10%灭活马血清2IMR-90成纤维细胞人肺MEM，10%胎牛血清和NEAA3W1-38成纤维细胞人胚胎肺，3月妊娠MEM,10%胎牛血清4A54