基因工程载体构建蛋白表达

（优选）基因工程载体构建蛋白表达当前第1页\共有50页\编于星期三\2点真核细胞与原核细胞的比较

特征原核细胞真核细胞细胞膜有（行使多种功能）有核膜

无

有染色体裸露DNA，无组蛋白DNA与组蛋白结合核外DNA含有质粒DNA线粒体与叶绿体DNA胞质区域化简单（无细胞器）复杂有各种细胞器细胞骨架无有（MT、MF、IF）核糖体70S型（30S和50S）80S型（40S和60S）细胞增殖无丝分裂有丝分裂、减数分裂当前第2页\共有50页\编于星期三\2点原核细胞与真核细胞的区别当前第3页\共有50页\编于星期三\2点原核表达与真核表达的区别原核基因表达以操纵子形式进行转录和翻译几乎同时进行真核转录在核内进行，先形成hnRNA,再加工剔除内含子，外显子相连，5’端加帽，3’端加polyA尾巴。翻译在胞浆的核糖体上进行当前第4页\共有50页\编于星期三\2点乳糖操纵子学说(原核基因的表达调控)当前第5页\共有50页\编于星期三\2点真核细胞的复制、转录、翻译当前第6页\共有50页\编于星期三\2点mRNA剪切当前第7页\共有50页\编于星期三\2点第一节外源目的基因在原核细胞中的表达原核基因表达载体的构成常见的原核细胞表达载体系统外源目的基因在原核细胞中的表达形式在原核细胞中高效表达目的基因当前第8页\共有50页\编于星期三\2点一、原核基因表达载体的构成DNA复制及重组载体的选择系统复制子:扩增选择标记：筛选外源基因的转录系统启动子抑制物基因转录终止子蛋白质的翻译系统

核糖体结合位点翻译起始密码子翻译终止密码子当前第9页\共有50页\编于星期三\2点启动子多克隆位点终止子ATGTAA目的基因DNA复制起始位点耐药性基因阻遏物基因表达载体当前第10页\共有50页\编于星期三\2点pBR322

old-style

generalpurposeplasmid4362bp当前第11页\共有50页\编于星期三\2点DNA复制及重组载体的选择系统

复制子：包含复制起始位点（ori)和有关序列在内的DNA片段。常见复制子有pMB1,p15A,ColE1和pSC101等。前3者为松弛复制型，含pSC101复制子的质粒载体严谨复制型。

选择标记：抗生素抗性基因当前第12页\共有50页\编于星期三\2点

外源基因的转录系统

启动子:能被宿主RNA聚合酶特异识别和结合并指导目的基因转录的DNA序列。启动子具有序列特异性、启动的方向性、作用的位置特性和种属特异性。诱导型启动子：Lac、Trp、Tac等组成型启动子：T7噬菌体启动子抑制物基因:其产物是控制启动子功能的蛋白质，对启动子的起始转录功能产生抑制作用。适当的诱导条件可使拟制物失活，启动子功能恢复。

转录终止子：终止RNA聚合酶转录的DNA序列。本正终止子：不需要其他蛋白辅助因子，依赖终止信号的终止子：依赖专一蛋白辅助因子（如ρ因子）

防止转录过头当前第13页\共有50页\编于星期三\2点3）蛋白质的翻译系统

影响翻译起始的因素：起始密码子、核糖体结合位点(SD序列)、起始密码与SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5’端非翻译序列和蛋白编码区的5’端序列核糖体结合位点翻译起始密码子翻译终止密码子当前第14页\共有50页\编于星期三\2点核糖体结合位点：原核生物转录起始位点(RBS)下游的一段DNA序列，由SD序列和起始密码子组成。SD序列大约3-9bp,位于ATG上游3-11bp处。SD序列可与核糖体16SrRNA特异配对而与宿主核糖体结合。大肠杆菌SD序列为5’AGGAGG3’，其中GGAG4碱基发生任何改变均大幅度降低翻译效率。当前第15页\共有50页\编于星期三\2点翻译起始密码子：一般为ATG(AUG),编码甲硫氨酸(Met),也有采用其他密码子。

影响翻译效率的因素有：SD序列、翻译起始密码子、SD序列和翻译起始密码子之间的距离和碱基组成等。据报道，SD序列后面为AAAA或UUUU时，翻译起始效率最高，而当为CCCC或GGGG时效率最低。当前第16页\共有50页\编于星期三\2点翻译终止密码子：它核糖体相遇时，能使核糖体从mRNA模板上脱落，终止翻译过程。大肠杆菌中多肽链的释放由释放因子RF1和RF2调控。RF1识别UAA和UAG,RF2识别UAA和UGA，故选UAA作终止密码子。可将几个终止密码子串联。据悉UAAU为有效终止密码子。当前第17页\共有50页\编于星期三\2点二、常见的原核细胞表达载体系统Plac启动子表达系统PL和PR启动子表达载体系统T7噬菌体启动子表达载体系统当前第18页\共有50页\编于星期三\2点三、外源基因在原核细胞中的表达形式包涵体融合蛋白寡聚型外源蛋白分泌型外源蛋白当前第19页\共有50页\编于星期三\2点（一）包涵体外源基因的高表达产物在原核细胞中积累，并致密地聚集在一起形成的一种不溶性蛋白质结构。或许也有一些受体细胞本身的蛋白质。包涵体具有正确的氨基酸序列，但空间构象错误，故没有生物学活性。需要复性当前第20页\共有50页\编于星期三\2点（二）融合蛋白定义：将外源目的蛋白的基因与受体菌自身蛋白基因重组，但不改变两个基因的阅读框而表达出的蛋白。外源基因宿主基因当前第21页\共有50页\编于星期三\2点融合蛋白的特点1.稳定性好单独的外源蛋白尤其是小分子蛋白，很容易被原核细胞中的蛋白水解酶所降解。融合蛋白中，外源蛋白在菌体自身蛋白的引导下，能正确折叠，形成杂合构象，封闭了暴露在分子表面的蛋白酶切割位点。当前第22页\共有50页\编于星期三\2点融合蛋白的特点2.表达效率较高转录和翻译由宿主菌的固有设施控制。3.易于分离纯化利用受体菌蛋白的特异性抗体、配体或底物亲和层析等技术，较容易地分离融合蛋白，然后通过蛋白酶水解，特异性裂解外源目的蛋白与受体菌蛋白之间的肽键，最终得到外源目的蛋白。当前第23页\共有50页\编于星期三\2点（三）寡聚型的外源蛋白…多个外源蛋白基因串联多表达单元的重组多顺反子重组多编码序列重组当前第24页\共有50页\编于星期三\2点多表达单元的重组：每个表达单元都含有独立的启动子、终止子、SD序列、起始密码和终止密码。表达分子量较大的蛋白，不需要裂解处理。启动子相互竞争ABCPromoterSDSDSD当前第25页\共有50页\编于星期三\2点

多顺反子重组：多拷贝的外源基因有各自的SD序列、翻译起始和终止密码，但转录在共同的转录启动子和终止子下进行。表达中等外源蛋白。ABCPromoterSDSDSD当前第26页\共有50页\编于星期三\2点多编码序列重组：多个基因串联，利用同一套转录调控元件、翻译起始与终止密码子，引入蛋白酶酶切位点或可被化学断裂的位点。ABCPromoter蛋白酶切位点当前第27页\共有50页\编于星期三\2点(四)整合型外源蛋白将要表达的外源基因整合到染色体的非必需编码区，使之成为染色体结构的一部分，而稳定遗传………本质为DNA同源交换。待整合的外源基因两侧必须带一段与染色体完全同源的的序列。同时将可控的表达元件和选择性标记基因连接在一起。一般选择不能自主复制的质粒或温度敏感型质粒。当前第28页\共有50页\编于星期三\2点（五）分泌型外源蛋白通过运输或分泌方式穿越细胞外膜进入培养基。需在N端加15-30个氨基酸组成的信号肽序列。信号肽N端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部氨基酸为疏水性氨基酸。当蛋白分泌到大肠杆菌细胞内外膜之间的外周质时，信号肽被信号肽酶切割。当前第29页\共有50页\编于星期三\2点分泌型表达的优点能使蛋白正确折叠分泌到胞外周质的蛋白较稳定，不易被胞内的蛋白酶降解，不含氨基端甲硫氨酸（Met)。简化了发酵后处理工艺。缺点：表达量不高，有时信号肽不被切割或切割不当。当前第30页\共有50页\编于星期三\2点四、在原核细胞中高效表达目的基因（一）高效表达外源基因的基本策略（二）目的基因表达水平的提高与检测当前第31页\共有50页\编于星期三\2点（一）高效表达外源基因的基本策略载体构建的优化

选用强启动子、强终止子使SD序列与核糖体16SrRNA的碱基完全配对调整SD序列与起始密码ATG之间的距离防止核糖体结合位点附近序列转录后的mRNA形成二级结构提高稀有密码子的表达频率通过点突变方法改造外源基因的稀有密码构建基因高表达受体菌大肠杆菌缺乏翻译后加工和蛋白质折叠系统提高外源基因表达产物的稳定性当前第32页\共有50页\编于星期三\2点提高外源基因表达产物的稳定性采用分泌型表达系统表达为融合蛋白构建包涵体表达系统选用蛋白酶缺陷型菌株作为受体菌外源蛋白中对水解酶敏感的序列进行修饰和改造当前第33页\共有50页\编于星期三\2点（二）目的基因表达水平的提高与检测采用定点诱变技术，使核糖体结合位点(SD序列，起始密码子ATG)的周围碱基发生改变，去除该区域的二级结构，以便提高基因表达水平。利用不同表达水平的宿主菌株在目的基因DNA下游接一段DNA序列，可以稳定mRNA从而提高翻译效果。通过改变温度、核糖体结合位点、启动子强度、质粒拷贝数或诱导物的量当前第34页\共有50页\编于星期三\2点目的基因表达产物的检测SDS和放射自显影当前第35页\共有50页\编于星期三\2点第二节外源目的基因在真核细胞中的表达真核表达载体的功能元件酵母表达系统当前第36页\共有50页\编于星期三\2点真核表达载体的功能元件启动子元件增强子元件加Poly(A)信号剪接信号与翻译相关的元件当前第37页\共有50页\编于星期三\2点增强子元件增强子：能够增强启动子转录活性的DNA序列。可以在转录起始位点上游或与启动子相距较远的位置上起作用。可以将几个增强子串联使用，从而大幅度提高启动子的转录水平。当前第38页\共有50页\编于星期三\2点二、酵母表达系统酵母基因表达载体的组成元件酵母基因表达载体的类型表达外源基因的酵母宿主菌当前第39页\共有50页\编于星期三\2点酵母基因表达载体的组成元件DNA复制起始序列选择（筛选）标记启动子分泌信号序列终止子有丝分裂稳定区当前第40页\共有50页\编于星期三\2点启动子长度约1-2kb。其上游有各种调控序列，例如上游激活序列、上游阻遏序列、组成型启动子序列等。启动子下游有转录起始位点和TATA序列。TATA序列可被转录因子蛋白识别、结合并形成转录起始复合物。强启动子：酵母磷酸甘油酯激酶(PGK)、甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)基因启动子等当前第41页\共有50页\编于星期三\2点分泌信号序列分泌信号序列引导分泌蛋白从胞内到胞外，并对蛋白质翻译后加工起作用。有α-因子前导肽序列，蔗糖酶信号肽序列，酸性磷酸酯酶信号肽序列等。其中酿酒酵母α-因子prepro信号序列最经典。理论上，可将外源基因与其天然信号序列、酿酒酵母α-因子前导肽或毕赤酵母酸性磷酸酶信号肽等任意一种结合共阅读框融合，构建分泌型表达质粒。当前第42页\共有50页\编于星期三\2点酵母基因表达载体的类型自主复制型质粒载体整合型质粒载体着丝粒型质粒载体酵母人工染色体当前第43页\共有50页\编于星期三\2点表达外源基因的酵母宿主菌酿酒酵母高密度培养产生乙醇积累，限制了酵母的继续生长和蛋白分泌巴斯德毕赤酵母甲醇营养菌，甲醇可诱导与甲醇代谢相关酶基因的高效表达，如AOX1的表达产物可在细胞中高水平积累。当前第44页\共有50页\编于星期三\2点YeastExpressionSystem30yearsago,KoichiOgatadiscoveredsomeyeastcouldliveusingcarbinalassolecarbonsource.ThepromoterofAOX1canbeactivatedstronglybycarbinal.WhereasthatofAOX2canonlybeweeklyelicited.So,theformerwasemployedwidelyinlabresearchandindustrialscaleup.当前第45页\共有50页\编于星期三\2点以AOX1为启动子，以AOX1基因缺失突变体为受体细胞，可高效表达外源基因。或用组氨酸脱氢酶突变体作为受体细胞，从而对携带his标记基因的转化子进行筛选。还有蛋白酶缺陷