实验室HBVDNA定量检测的临床意义

沈弢北京大学病原生物学系taoshen@2013-06-021“十一五”重大传染病专项计划病毒性肝炎重大研究专项启动(2009年)

核心电子器件、高端通用芯片及基础软件新产品极大规模集成电路制造装备与成套工艺新一代宽带无线移动通信网高档数控机床与基础制造装备大型油气田及煤层气开发大型先进压水堆及高温气冷堆核电站水体污染控制与治理转基因生物新品种培育重大新药创制艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治大型飞机高分辨率对地观测系统载人航天与探月工程表1、国家中长期科技发展规划纲要（2006~2020年）确定的重大科技专项Hepatology,2009JHepatol,2012●2012：为了避免乙肝复发，HBVDNA需控制在实时荧光PCR检测不到的水平（＜10-15IU/ml）。HBVDNA的监测是检测治疗失败的关键。●2009：目前，HBVDNA实时荧光定量PCR的灵敏度以达到5-10IU/ml，检测上限以达到8-9log10，用高灵敏度的定量检测试剂准确检测血清HBV-DNA是乙肝抗病毒治疗过程中疗效观察和治疗终点判定的关键因素。超敏感（Hypersensitivity）—乙肝检测灵敏度应达到10-15IU/ml，丙肝检测灵敏度达到50IU/ml，从而帮助医生确定治疗终点，同时及时监测耐药的发生。宽线性范围（widerdynamicrange）—试剂盒线性定量范围应为1-9log10IU/ml，以帮助医生准确测定病毒感染的基线水平，并有效评估抗病毒治疗的效果，为患者提供最优治疗方案。高特异性（Highspecificity）—试剂盒应能够检测肝病毒各基因亚型，有效避免假阴性及漏检情况的发生。可重复性好（Repeatability）—试剂盒操作过程要简单，以最大程度上减少操作误差，同时检测结果的重复性要好，以保证肝病治疗过程中监测指标的准确性和有效性。国际指南对HBVDNA检测的要求我国曾是世界上HBV感染流行最高的地区之一WHO/CDS/CSR/LYO/2002.2:HepatitisB9.75%1/49300万慢性HBV感染者1/32千万~3千万慢性乙肝患者>1/2~30万肝癌患者全国13亿人口，5-6亿曾感染HBV,占全国总人口近40%1~59岁人群血清HBsAg流行率7.18%(2006)FMLu,etal.J.ofViralHepatitis2009FMLu&HZhuang.ChinessJ.ofMedicineX.Liang,etal.J.ofInfectiousDisease,2009X.Liang,etal.Vaccine,2009（一）慢性乙型肝炎

（二）乙型肝炎肝硬化（三）携带者（四）隐匿性慢性乙型肝炎慢性乙型肝炎临床诊断类型

临床诊断临床症状、疾病史实验室诊断生化学检查HBV血清学检测（抗原/抗体系统）HBVDNA（基因型、亚型和变异检测）病理学诊断影像学诊断

诊断依据慢性HBV感染临床诊断HBV携带者(HBVDNA+)携带者慢性乙肝HBeAg-慢乙肝乙肝肝硬化乙肝相关肝癌隐匿性慢性乙肝非活动性HBsAg携带者(HBVDNA－)轻、中、重活动期和静止期代偿期失代偿期HBeAg+慢乙肝医药科技的进步已经使慢性乙型肝炎已成为可以治疗的慢性疾病2005年我国制定了第一部《慢性乙型病毒性肝炎防治指南》规范的抗病毒治疗可以有效地阻断或减缓疾病进展、减少终末期肝病的发生免疫耐受期HBeAg+HBeAg-/anti-HBe+(preC/corepromotermutants)

HBVDNA<2000IU/mL>2000IU/mL>2x107

IU/mL>2x104IU/mL(HBeAg+CHB)(Inactive-carrierstate)(HBeAg-CHB)ALTNormal/minimalchange/mildCHModerate/severeCHModerate/severeCHNormal/mildCH

moderatefibrosisCirrhosisCirrhosisInactivecirrhosis2-6%/yr8-10

%/yr20-30%ModifiedfromLoketal.Hepatology2007;45:507-539Pungpapongetal.MayoClinProc2007;82:967-975.免疫清除期（免疫活动期）免疫控制期(低病毒复制期)再活动期侯金林教授惠许抗病毒治疗抗病毒治疗临床治疗的进步对实验室检测提出了新的要求慢性HBV感染分期及相关实验室检测指标鲁凤民，庄辉，乙型肝炎实验室诊断研究进展2009慢性乙型肝炎的诊断开展抗病毒治疗的重要指标：

HBeAg阳性慢乙肝患者：HBVDNA≥20000IU/mL，伴有肝脏损伤者(ALT升高，或肝活检发现肝脏炎症)；HBeAg阴性慢乙肝患者：HBVDNA≥2000IU/mL伴有肝脏损伤指标，即应开始抗病毒治疗。代偿期肝硬化患者：HBVDNA

+HBVDNA的定量检测已经成为临床治疗的关键指标HBVDNA的定量检测已经成为临床治疗的关键指标判断抗病毒治疗疗效（RGT）以治疗24周时血清HBVDNA绝对水平判断：完全病毒学应答：低于60IU/mL部分应答：

低于2000IU/mL应答不充分： 60IU/mL～2000IU/mL例如：HBVDNA载量检测在治疗优化路线图中的作用例如：HBVDNA载量检测在治疗优化路线图中的作用HBVDNA的定量检测已经成为临床治疗的关键指标在多个国家和地区的慢乙肝防治指南，均把用灵敏的PCR检测方法检测不到HBVDNA作为停药的重要指证。DomesticAAmpllcorMonltorCobasTaqManRealArtHBVLCPCR(ArtusBiotech)AbbotReal-timeHBV(Abbott)VersantHBVDNA1.0(kPCR,Siemens)10102103104105106107108109(IU/mL)HBVDNA定量检测试剂及其检测灵敏度和线性范围DomesticB以上数据来源：各企业试剂说明书国产乙肝病毒DNA定量试剂在检测方法上与进口试剂存在明显差别原因分析一步法煮沸释放HBVDNA+定量扩增自动化提取制备HBVDNA+扩增检测VS1ul国产试剂的实际用于检测的血清量仅为1ul200ul国内现有核酸检测技术流程PCR体系配置核酸提取荧光PCR仪器操作PCR体系配置，核酸提取，荧光PCR检测。一站式全自动检测！国外的全自动核酸检测仪器国产乙肝病毒DNA定量试剂质量的提高需向系统（试剂+体系）转换对策1：技术进步，全自动的核酸提取设备+基于开放设备的定量试剂√对策2：通过行政手段淘汰劣质试剂；√

对策3：由维价格论→综合考虑质量与价格√我们已经完成配合自动化仪器的磁珠核酸提取试剂，达到国外先进水平。圣湘公司磁珠法提取效果国外著名C公司提取效果圣湘公司自主研发的核酸提取试剂（磁珠法），实现了DNA/RNA共提取。效果等效于国外著名同类试剂。HBV灵敏度可达10IU/ml，HCV灵敏度达20IU/ml。10IU/ml磁珠核酸提取试剂可在各种不同仪器上进行下游检测29定量检测HBV感染者血浆(清)HBVDNA是了解肝内HBV复制水平的可靠指标，也是HBV感染诊断、疗效监控和指导用药的重要指标。近年，国产试剂的质量得到很大改进，但多数试剂的灵敏度、准确性及重复性等与进口优质试剂相比，仍存在较大差距。尤其对低病毒载量或存在干扰物质的临床标本进行检测时，差距更为明显。目前我国市场上主流的国产HBVDNA定量试剂盒多是基于即将废除的煮沸法核酸提取方法，检测下限一般为500~1000IU/ml，不能满足临床诊断的需求。在国家“十二.五”传染病防治重大专项“乙型病毒性肝炎临床诊断及监测技术的研究”的支持下，基于磁珠法核酸提取的国产HBVDNA定量试剂盒已成为主流研发方向。30

对国产湖南圣湘乙型肝炎病毒核酸定量检测（PCR-荧光探针法）试剂盒的可溯源性、准确度、精密度和临床应用进行质量考评。31用基于磁珠法自动化核酸提取平台的该国产HBVDNA定量试剂盒和罗氏HBVDNA定量试剂盒对WHO的HBVDNA系列稀释标准品(50、200、2000、20000IU/ml)进行溯源性分析，确定试剂盒检测的可靠性。用这2种试剂盒对HBVB和C基因型标准血浆(分别稀释为25、50、200、2000、20000、200000IU/ml)分别在三个不同检测中心共进行216次平行检测，比较其准确度和精密度。用2种方法平行检测5份HBVDNA阴性血浆样本和37份不同病毒载量的HBVDNA阳性临床血浆标本，并评价其相关性和符合率。32罗氏

COBAS罗氏COBASVersion2.0雅培RealtimeHBVDNA湖南圣湘新型HBVDNAkit样本用量850μl500μl200μl或500μl200μl核酸提取方法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法自动化仪器，磁珠法检测下限(LOD)12IU/mL(EDTA血浆)9IU/mL(EDTA血浆)或19IU/mL(血清)10IU/mL或15IU/mL(EDTA/ACD血浆、血清)10IU/mL(血清)线性范围54.5-1.1×108IU/mL20-1.7×108IU/mL10-1.0×109IU/mL(500μl)15-1.0×109IU/mL(200μl)20-2.0×109IU/mL临床特异性100%100%>99.5%100%适用基因型基因型

A-G基因型A-H,包括

pre-core突变基因型A-H基因型A-H储存条件2-8℃2-8℃-20℃orcolder核酸提取试剂2-8℃；扩增反应试剂-20±5℃。有效期18个月25个月12个月9个月33RocheCOBASRocheCOBAS2.0湖南圣湘滴定度结果报告结果NotdetectedHBV的Ct超出该检测试剂的界限之上或没有得到HBV的Ct值。报告“没有检测到HBVDNA”。<12IU/mL检测到HBVDNA，低于12IU/mL。≥12IU/mL和<54.5IU/mL所得结果低于该测试的线性范围下限，结果具有高度变异性，应谨慎解释。≥54.5IU/mL和≤1.10E+08IU/mL结果在线性范围以内。>1.10E+08IU/mL结果在检测范围之上。可稀释后重复检测，报告结果乘以稀释因子。滴定度结果报告结果NotdetectedHBV的Ct超出该检测试剂的界限之上或没有得到HBV的Ct值。报告“没有检测到HBVDNA”。<20IU/mL检测到HBVDNA，低于20IU/mL。≥20IU/mL和≤1.70E+08IU/mL结果在线性范围以内。>1.70E+08IU/mL结果在检测范围之上。可稀释后重复检测，报告结果乘以稀释因子。滴定度结果报告结果<10IU/mLHBVDNA含量低于试剂盒检测下限。≥10IU/mL和<20IU/mLHBV病毒载量低，测定值仅供参考。≥20IU/mL和≤2.0E+09IU/mL结果在线性范围以内。>2.0E+09IU/mL结果在检测范围之上。可稀释后重复检测，报告结果乘以稀释因子。滴定度结果报告结果Notdetected未检测到目标(Targetnotdetected)<10IU/mL(500μl样本量)<15IU/mL(200μl样本量)检测到HBVDNA，低于线性范围下限。10-1.0E+09IU/mL(500μl样本量)15-1.0E+09IU/mL(200μl样本量)结果在线性范围以内。>1.0E+09IU/mL结果在检测范围之上。可稀释后重复检测，报告结果乘以稀释因子。ABBOTTkit34PrincipalInvestigator(负责人）Site（地点）Reproducibility(可重复性检测）Traceability（对WHO标准品的可溯源性分析）鲁凤民北京大学医学部微生物系╳╳谭德明长沙湘雅医院传染病科╳陈德喜首都医科大学附属佑安医院╳35购买获得WHOHBV-DNA标准物质，用于评价不同公司HBV-DNA定量检测方法的可溯源性（traceability）。HBV标准品将用HBV阴性EDTA抗凝血浆进行稀释。稀释浓度初步设定为50、200、2,000/20,000IU/mL四个临床治疗关键的节点浓度值。每天每种仪器检测上述稀释浓度样本一个反应（含对照管）。共检测三天（即每种浓度检测3次）。以上检测均在北京大学医学部微生物系进行。36WHOgenotypeA2PanelRocheCOBAS2.0SansureRep1Rep2Rep3Rep1Rep2Rep3Day1:Day2:repeattheabovetestingpatternDay3:repeattheabovetestingpatternNIBSC：英国国家生物标准与检定所37试剂理论值(IU/ml)理论值(lgIU/ml)实测值(lgIU/ml)相对偏差(lgIU/ml)标准差(lg

IU/ml)圣湘(PCR-荧光探针法)501.6991.524-0.1760.2072002.3012.119-0.1820.20520003.3013.126-0.1750.095200004.3014.145-0.1560.103罗氏

(COBAS2.0)501.6991.579-0.1210.0292002.3012.056-0.2450.09220003.3013.030-0.2710.131200004.3014.135-0.1660.20238由第三方提供高浓度的HBVB&C亚型标准血浆。血浆HBV病毒载量须大于1,000,000。以上血浆用HBV阴性EDTA抗凝血浆进行稀释。稀释浓度设定6个评价节点：25、50、200、2,000、20,000、200,000IU/mL。每天每种仪器检测上述稀释浓度样本一个反应（含对照管）。共检测三天（即每种浓度检测3次）。准确度判断标准为所有检测节点上的的相对偏差

均在±0.3lg

IU/ml之内为可接受范围。精确度判定依据对同一检测节点平行检测9次后的变异系数，变异系数越小意味精确度越高。以上检测将在北京大学医学部微生物系、首都医科大学附属佑安医院、湖南湘雅医院传染病科三地多中心同时进行。

HBVB基因型标准血浆：卫生部国家临检中心惠赠，编号GBW09150，浓度为1.2×106IU/ml。HBVC基因型标准血浆：中国药品生物制品检定所惠赠。浓度为2×108IU/ml。39Day1:Day2:repeattheabovetestingpatternRep1Rep2Rep3Rep1Rep2Rep3SansureGenotypeBPanelRocheRep1Rep2Rep3Rep1Rep2Rep3SansureGenotypeCPanelRocheDay3:repeattheabovetestingpattern40HBV基因型评价试剂理论值

(IU/ml)理论值

(lg

IU/ml)检测次数实测值

(lg

IU/ml)实测值

(IU/ml)相对偏差(lg

IU/ml)方差（标准差）(lgIU/ml)Lognormal

CV%HBVB型湖南圣湘试剂(PCR-荧光探针法)251.39891.36223.7-0.0360.013(0.114)8.38501.69991.70452.50.0050.017(0.130)7.612002.30192.3412260.040.012(0.110)4.7420003.30193.36123500.060.009(0.097)2.70200004.30194.342226000.0410.012(0.108)2.492000005.30195.3282160000.0270.006(0.079)1.49罗氏试剂

(COBAS2.0)251.39891.64246.90.2440.027(0.167)10.17501.69991.94588.70.2460.003(0.054)2.802002.30192.4913170.190.011(0.106)4.2720003.30193.51833200.2170.003(0.056)1.59200004.30194.581384000.280.003(0.059)1.282000005.30195.3982510000.0970.002(0.048)0.89HBVC型湖南圣湘试剂(PCR-荧光探针法)251.39891.32522.8-0.0730.027(0.166)12.52501.69991.69352.6-0.0060.025(0.157)9.292002.30192.3482370.0470.024(0.155)6.5820003.30193.2952080-0.0060.023(0.153)4.53200004.30194.304204000.0030.006(0.077)1.802000005.30195.3292170000.0280.007(0.083)1.56罗氏试剂

(COBAS2.0)251.39891.540390.1420.049(0.222)14.41501.69991.78564.50.0860.024(0.156)8.752002.30192.277206-0.0240.035(0.188)8.2420003.30193.35123800.050.024(0.154)4.60200004.30194.371258000.070.035(0.188)4.302000005.30195.3252230000.0240.023(0.152)2.8541国产新型试剂盒的检测结果较稳定，相对偏差均在±0.1lg

IU/mL范围内。罗氏试剂盒的检测结果尽管均在可接受范围内，但针对B基因型标准血