心力衰竭药理学研究进度

心力衰竭药理学研究进度

表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因及基因表达发生了可遗传的变化。这些改变包括DNA的甲基化、多种形式的组蛋白修饰及小分子RNA等。个体间疾病易感性及治疗反应性的差异在很大程度上取决于遗传因素[1]。然而，根据全基因组研究，笔者不得不承认遗传表型的改变不仅仅是核苷酸序列的变化[2-3]。表观遗传学与核苷酸的改变共同调控了基因的表达，因而从另一种角度解释了个体间的差异。

表观遗传学研究发现，基因及其表达的遗传性改变不仅仅是指基因突变或基因多样性等DNA序列的变化。已知的三种可调节基因表达的表观遗传学改变主要是：基因组DNA的甲基化，组蛋白修饰，非编码RNA的调节。上述机制均涉及外在因素在蛋白质编码序列不变的情况下仍可调节基因转录[4]。表观遗传学调节机制存在个体及组织差异性，并且可以随年龄增长、环境及疾病状态的改变而变化。表观基因组在基因组表达过程中起关键作用，个体间基因表达的不同造成药物不同的反应性，这可能是通过表观遗传学改变进行调节的。因此，目前认为表观遗传学改变可以帮助解释基因突变在药物反应中的作用，继而在临床医学中发挥作用，这一迅速崛起的新学科称为表观遗传药理学。个体间药物的反应性不同，该学科不仅研究表观遗传因子在这一过程中的作用，而且旨在开发新的药物靶点[5]。笔者认为表观遗传药理学与遗传药理学将共同在药理学、临床医学中发挥重要作用。目前为止，表观遗传药理学的大多数研究集中于肿瘤学领域，例如，研究细胞色素p450在个体间表达的差异。幸运的是，表观遗传学修饰的作用已被应用于解释其他复杂并且多源的现象，应用的范围越来越广。在这里，笔者总结了表观遗传修饰在心衰及心血管疾病治疗方面最新的研究。

1表观遗传修饰与心力衰竭

组蛋白的修饰

庞大的真核生物基因组在高度保守的组蛋白的作用下得到了紧密的压缩。在核小体中，基因组DNA围绕核心组蛋白折叠、压缩，形成了染色体的基本单位。基因组DNA与染色体蛋白的相互作用有助于转录因子向靶基因片段聚集，从而调节转录活性[6]。通过这种机制，核小体利用其核心组蛋白的共价修饰传递表观遗传学信息。这些修饰包括组蛋白乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化及SUMO化修饰。核心组蛋白的氨基末端从染色质丝上伸出来，与DNA或其他组蛋白、蛋白质等相互作用。该末端上的赖氨酸、精氨酸残基是组蛋白修饰的主要靶点。多数研究旨在了解赖氨酸乙酰化、甲基化的作用。事实证明，赖氨酸的乙酰化作用主要与染色质亲和力及转录相关，而赖氨酸的甲基化作用取决于何种残基被修饰。有趣的是，正如Mano所总结的那样，组蛋白乙酰化的调控与心肌肥厚相关。去氧肾上腺素可诱导心肌细胞肥大，这一过程需要乙酰基转移酶介导的组蛋白乙酰化。与此结果相一致的研究是针对Ⅱ类组蛋白去乙酰基酶5、9的研究，其通过抑制心肌细胞增强因子2的活性进一步阻碍致肥厚基因的表达来发挥抗肥厚的作用。与此相反，Ⅰ类HDACs具有相当强的致肥厚作用，其通过调节磷脂酰肌醇三磷酸酰胺磷酸酯酶的表达发挥作用。这意味着，HDACs在多水平上控制肌肉细胞的体积。

甲基化

在真核生物中，DNA甲基化是通过将甲基团转移到核苷酸胞嘧啶环的5''''位碳原子上完成的。在哺乳动物体内，DNA甲基化主要发生在基因的5''''-CG-3''''序列，也指的是CpG双核苷酸；人体内，大约70%的CpGs发生甲基化。另一方面，未甲基化的CpGs存在于许多基因的5''''端调控区域，以CpG岛的形式出现。与其他DNA区域相比，CpG双核苷酸在CpG岛出现的概率较高。人体内CpG岛甲基化的不同是表观遗传学改变的组成部分。DNA胞嘧啶甲基化有助于局部转录因子复合物的结合，其与组蛋白修饰共同在局部及整个基因组中影响染色体的结构。因此，DNA甲基化的一个重要作用是调控基因的表达。在这方面，CpG岛超甲基化可以使基因沉默，而低甲基化使基因发生转录。有人认为，甲基化是一种稳定遗传的修饰，但同时它也受到环境因素的影响。如小鼠野鼠色基因位点，可以受到其上游转座子甲基化状态的影响。从遗传角度来讲，完全相同的亲代其野鼠色基因不同的甲基化状态可使得后代出现不同的毛色[7]。最近，Kao等[8]的研究结果发现，DNA甲基化在心衰特定的基因转录调控中发挥作用。他们发现促炎症基因TNF-α可下调肌浆网Ca2+-ATPase的表达，这是通过增强SERCA2A启动子的甲基化状态完成的。Movassagh等[9]发现，在心肌病及人类心肌组织形成时甲基化的状态是不同的。而且，他们鉴别出三个基因位点，在不同的心脏样本中，位点甲基化状态与基因表达的调控密切相关。

MicroRNAs是短的双链RNA分子，来源于细胞核及细胞质中较大的RNA前体，其可以在基因转录后对基因表达发挥调节作用。miRNAs可以对30%～50%的蛋白质编码基因进行调控，这一过程主要是通过与mRNA3''''端未转录区域的碱基对进行互补结合，继而干扰转录，靶mRNAs可降解或暂时沉默[10]。miRNAs调节蛋白的表达是非常复杂的，多种miR-NAs可以作用于同一基因，不同基因也可受到同一种miR-NAs的调节。miRNAs的表达具有组织、疾病特异性。近年来，多种病理状态下的miRNA分子标记已被检测出来，如各种类型的肿瘤以及多种心血管疾病[11]。越来越多的证据表明，miRNAs与基本的细胞功能密切相关。目前，miRNAs与心衰的关系已得到明确，在过去的几年中，该领域的报道层出不穷。对心血管疾病的研究主要集中于两种心脏组织特异表达的miRNA家族。多项研究显示，miRNA在健康、高血压以及不同病因所导致的人、小鼠、大鼠衰竭的心脏中均有表达，Divakaran等[12]发现心脏特异性的miRNA-208不仅可调节心肌细胞肥大、纤维化同时可在应激、甲退时调节β-肌球蛋白重链的表达。这种miRNA由α-MHC基因的内含子编码。该基因编码α-MHC及一种主要的心肌收缩蛋白，使心脏变大，在应激以及激素信号作用下通过miR-NA-208及其作用位点发挥调节作用。再者，定向删除心肌特异性的miRNA，miRNA-1-2，揭示了它们在心脏中的多种功能，包括调节心脏的形态发生、电信号传导及细胞周期的调控。Thum等[13]发现，受损心肌中miRNA标记与胚胎心中miRNA表达的类型极为相似，这说明受损心肌中重启了胚胎基因的表达程序。Thum等[13]另一个发现是miRNA-21可以调控ERK-MAP激酶途径，这种调控在心脏成纤维细胞中尤为明显，心肌细胞中却没有这种表现，这可以影响到心脏的结构及功能。在成纤维细胞中，miRNA-21水平的增高可通过抑制特定基因来激活ERK激酶，经由这种机制，miRNA-21调节了间质纤维化、心肌肥厚。上述研究揭示了在心脏成纤维细胞中，基因调节的另一种方式是在miRNA介导的旁分泌水平上进行的。miRNA在心脏肥厚反应中的意义得到了进一步的研究，miRNA成为基因调控的主要调节因子。到目前为止，miRNA已被证实不仅可以影响心肌，还可以影响心脏电信号转导及调节血管再生[14]。

2表观遗传筛选方法

表观基因组学示意图不是固定的，它因细胞类型、时间的不同而不同，并且可在生理学、病理学、药物作用情况下发生改变。因此，作为人类基因组计划的后续工程，表观基因组测序是一项艰巨的任务。虽然判断基因组序列的表观遗传学状态是比较容易完成的，描绘整个表观基因组需要对数十个基因组进行测序，覆盖一个有机体在生命不同阶段的所有细胞类型。亚硫酸氢盐测序法是标测DNA甲基化类型最为准确的方法。基因组DNA与亚硫酸氢钠相作用，导致未甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。为观察特定基因的甲基化状态，用特异性引物对目的片段进行扩增，随后对产物测序。在序列中，甲基化的胞嘧啶被标记为Cs，未甲基化的胞嘧啶为Ts。近来出现了多个对甲基化进行定位的全基因组研究方法，它们都是以甲基化和未甲基化的CpGs对限制性内切酶的敏感性不同为基本原理的。限制长度的基因组扫描利用两种酶双酶切DNA，一种是频繁切割的甲基化非敏感性限制内切酶，另一种是罕见的甲基化敏感性的酶如Not1，这种酶只有在非甲基化状态时才可以酶切所识别的位点。还有一种完全不同全基因组研究方法是利用DNA芯片技术，它可以一次性标测成千上万的CpG岛的甲基化状态。这种方法可以用来识别CpG岛，相对于正常的调控过程来说，CpG岛在肿瘤组织中发生甲基化。亚硫酸盐转化的替代方法是ChIP-seq方法。通过免疫共沉淀技术使得目的蛋白与DNA发生交联，然后对DNA片段进行基因组测序。这一方法可以帮助识别任何DNA相关蛋白的DNA结合位点。该技术还可以提供组蛋白修饰的信息，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、SUMO化修饰。对ChIP技术进行改进得到的DCS方法，是将ChIP与消减式PCR进行偶联。该方法旨在避免基因组片段与芯片杂交后产生非特异性信号。以同样的方式可以检测人体病理状态下miRNA的作用，大多数研究是利用高通量的方法分析临床病例中总miRNA的表达情况。高通量技术是以miRNA基因芯片和real-timeRCP为代表的。尽管分子间的差别给这些技术带来了巨大的挑战，但miRNA芯片最大的优点是具有很高的特异性，而缺陷是其敏感性较低。

3药物可以改变表观遗传状态

表观遗传学改变正常及疾病状态下的表型，这可能意味着充分理解和调控表观基因组对于人类常见疾病的防治具有重要意义。表观遗传学为我们提供了一个重要的窗口，来认识环境与基因在疾病发生过程中的相互作用以如何调节这些作用达到改善人类健康的目的。miRNA派生的反义寡核苷酸是单链RNA分子，对其进行化学修饰可能是针对致病miRNA新的方法。但是这种方法困难重重，miRNA属于密切相关的家族，且很难合成针对每一种miRNA的反义寡核苷酸。再者，一个单独的miRNA可针对多种基因发挥作用，它们之中可能含有对心肌有益的分子。在这方面，寡核苷酸的化学修饰可能会特异性破坏miRNA与单个mRNA的作用，这可能是疾病治疗良好的备选方案。每一种miRNA可以以不同的强度针对成百上千的基因发挥作用，所以在体内miRNA修饰的最终作用尚不明了。最终，将miRNA拮抗剂应用于临床领域将面临很多困难，这与我们在基因治疗方面所遇到的极为相似，如导入方式、载体、特异性以及毒性等问题[15]。至少在理论上，针对特异性miRNA的方法将来可能是治疗缺血性心脏病、心肌肥厚、心衰、血管再生、离子通道病的有效手段，可控制心衰的发展。另一种方法可能是将靶DNA甲基化。一些影响基因组DNA甲基化的化学合成剂已经应用于临床，例如5-氮胞嘧啶、抑制甲基转移酶的氮胞嘧啶可以使DNA片段脱氨基。其它药物是通过阻碍甲基化酶的活性而发挥抑制甲基化作用。更多信息可参照Gomez等[16]的文章。除了要开发可以调节DNA甲基化的药物外，还需要设计可以影响组蛋白修饰的药物。在抗肿瘤药物的发展过程中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂占据着重要地位，它可以通过逆转与肿瘤相关的异常表观遗传改变，继而发挥作用。已有证据表明，在心肌肥厚时，HDAC抑制剂可修复基因表达程序。Gallo等证明体外试验中，曲古霉素A、丁酸钠可延缓心脏肥厚。

4表观遗传学和环境

众所周知，环境因素如毒素、饮食可以影响DNA甲基化和染色质修饰，并且可遗传给下一代。雌激素、抗雄激素类物质可改变DNA甲基化状态降低男性的生育能力，这也是可遗传的。该假说认为，环境因素可以改变表观遗传学标记和基因表达形式，这可能在人类疾病研究中具有重要意义。常见疾病大多受到基因和环境因素的双重影响，环境可诱导表观遗传结构发生改变，进而将基因和环境因素联系起来[17]。年龄在基因与环境相互作用中发挥重要作用。常见病的发病率随着年龄的增加不断增高，这与在人的一生中表观遗传学改变不断累积有关。有研究发现，相对于年轻者而言，年长的同卵双胞胎体内总DNA甲基化及组蛋白H3K9乙酰化的水平较高，但该研究没有检测同一个体中表观遗传学改变随时间变化的情况。

5结论

表观遗传学为研究个体在临床疗效、药物反应及毒性间的差异，以及发现新的药物治疗靶点等方面开