实验质粒DNA的转化

实验四、质粒DNA的转化

一

实验目的

二

实验原理

三

材料仪器

四

实验步骤

五

实验结果图

六

结果讨论

七

思考题一、实验目的学习将外源质粒DNA转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。

转化（transformation）:把外源DNA分子导入到某一宿主细菌细胞的过程称为转化。当细菌处于容易吸收外源DNA的状态即感受态时，转化最易发生。当受体菌处于感受态时，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羧基钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收外源DNA。在培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。被转化的细菌中，载体中抗抗生素基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子（transformant）。二、实验原理三、材料仪器实验仪器

超净工作台、恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、涂布棒，微量取样器，冰盒等。实验材料大肠杆菌DH5α感受态细胞；质粒DNA:pCR4ToPoGt5GT7(Kan+Amp抗性)；LB固体培养基；含Kan+Amp的LB固体培养基：将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右，加入Amp和Kan储存液，使终浓度分别为50µg/ml，摇匀后铺板。1．从冰箱中取出感受态细胞，放置冰上；2．每组分别取2管20µl感受态细胞悬液；第一管为转化实验组：1µl重组质粒DNA+20µl感受态细胞；第二管为阴性对照组；加入1µl无菌水+20µl感受态细胞悬液；轻轻摇匀，冰上放置30分钟；3．将管放入42℃恒温水浴中90秒，迅速将eppendorf管移到冰浴上，冷却2min；四、实验步骤+420C热击370C复苏Kan+Amp筛选感受态细胞质粒DNA4.向上述eppendorf管中加入200uLLB液体培养基（不含抗生素），混匀后37℃振荡培养20min，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗性基因；5.将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含Kan+Amp的筛选平板上，涂布之后，在37℃培养箱中正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养12-16小时；6.涂布细则如下表：组别培养皿编号DNA/μl灭菌水/μl平板抗性受体菌/μl11-1-对照-无—1无1001-1-对照-Amp+Kan

—1Amp+Kan1001-1-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10021-2-对照-无—1无1001-2-对照-Amp+Kan

—1Amp+Kan1001-2-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10031-3-对照-无—1无1001-3-对照-Amp+Kan

—1Amp+Kan1001-3-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10041-4-对照-无—1无1001-4-对照-Amp+Kan

—1Amp+Kan1001-4-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10051-5-对照-无—1无1001-5-对照-Amp+Kan

—1Amp+Kan1001-5-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan100组别培养皿编号DNA/μl灭菌水/μl平板抗性受体菌/μl61-6-对照-无—1无1001-6-对照-Amp+Kan

—1Amp+Kan1001-6-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10071-7-对照-无—1无1001-7-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-7-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10081-8-对照-无—1无1001-8-对照-Amp+Kan—1Amp+Kan1001-8-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan10091-9-对照-无—1无1001-9-对照-Amp+Kan

—1Amp+Kan1001-9-转化-Amp+Kan1—Amp+Kan100涂布棒的使用1、使用前，浸入75%酒精中；2、在酒精灯上引燃涂布棒上的酒精（不要烧到手）；3、等酒精烧完后，让涂布棒在空气中冷却；4、涂布均匀；5、将涂布棒重新除菌以备下一次使用；6、阴性对照与重组DNA的涂布棒区别使用，避免DNA污染。

A(对照-Amp+Kan):100ul菌液涂布于LB+Amp+Kan培养基，菌落生长情况;B(转化-Amp+Kan):100ul菌液涂布于LB+Amp+Kan培养基，菌落生长情况;C(对照-无):100ul菌液涂布于LB培养基，菌落生长情况;BCA五、实验结果图六、结果讨论转化过程中的影响因素1．受体细胞的生长状态和密度

细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的A600控制。2．质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但外源DNA的量过多时，则会使转化率下降。一般来讲，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的超螺旋DNA即可使50µl的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10-100倍。3．试剂的质量化合物及无机离子的影响：所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，分装保存于4℃。在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高。4．防止杂菌和杂DNA的污染整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。5．整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。七、璃思津考芦