第二章第一节基因操作的工具酶

基因工程张锐第二章基因操作原理第一节分子克隆的工具酶第二节载体第三节电泳技术与分子杂交技术第四节聚合酶链式反应第五节基因克隆的策略第六节生物芯片第七节基因文库的构建第八节分子标记技术第一节基因操作的工具酶一限制性核酸内切酶及其应用二DNA连接酶及其应用三DNA聚合酶及其应用四修饰性工具酶Geneticengineeringislargelyanexerciseincarefullycontrolledenzymology.Avarietyofenzymesformthebasictoolkitofthegeneticengineer.

1、限制性核酸内切酶的发现2、限制性核酸内切酶的分类和命名3、II型限制性核酸内切酶的基本特性4、限制性核酸内切酶的消化反应一限制性核酸内切酶及其应用50年代初发现了由寄主控制的限制和修饰现象(K)(B)大肠杆菌B大肠杆菌K1110—

410—4E.O.P成斑率efficiencyofplating1、限制性核酸内切酶的发现E.coliC100%限制—修饰的酶学假说(B)(B)酶切位点不被修饰噬菌体DNA被切割酶切位点被修饰Methylation基因组DNA不被切割1968年，Meselson和Yuan从大肠杆菌K和B中发现了I型限制性核酸内切酶；1970年，Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离纯化了第一个II型限制性核酸内切酶HindII，使得DNA分子的体外精确切割成为可能。KKBB限制性核酸内切酶的概念

限制性核酸内切酶（Restrictionendonucleases）：是一类能够识别双链DNA分子中某种特定的核苷酸序列，并能精确特异地切割双链DNA分子的核酸内切酶。已经从近300中微生物中分离出了500余种限制性核酸内切酶。2、限制性核酸内切酶的分类合命名限制性核酸内切酶的分类1.限制修饰活性2.内切酶的蛋白质结构3.限制辅助因子4.切割位点5.特异性切割6.基因克隆中I型单一多功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点1000bp不是无用II型限制酶和修饰酶分开单一成分Mg2+特异性位点及其附近是非常有用III型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特异性位点3‘端24-26bp处是有用限制性核酸内切酶的命名1、寄主菌属名的第一个字母（大写）和种名的头两个字母（小写）组成3个斜体字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichiacoli

表示为Eco,流感嗜血菌Hemophilusinfluenzae

表示为Hin；2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如EcoRI、HindIII。EEscherichia(属)cocoli(种)RRY13(品系)I首先发现在此类细菌中发现的顺序3.II型限制性核酸内切酶的3大特点1、识别位点的特异性每种酶都有其特定的DNA识别位点，通常是由4、5、6或7个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。2、识别序列的对称性

靶序列通常具有双重旋转对称的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性

双链DNA被酶切后，分布在两条链上的切割位点旋转对称（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。与II型核酸内切酶有关的几个概念粘性末端

cohesive

ends因酶切位点在两条DNA单链上不同（对称）酶切后形成的具有互补碱基的单链末端结构，酶切产生的两个粘性末端很容易通过互补碱基的配对而重新连接起来。平末端

Bluntend因酶切位点在两条DNA单链上相同，酶切后形成的平齐的末端结构，这种末端不易重新连接起来。同位酶识别相同序列的酶称为同位酶。同裂酶

isoschizomers能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同内切酶。（切割位点不同）（同序同切酶、同序异切酶）同尾酶

isocaudamers识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。注意：由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点PstIProvindenciastuartii164

CTGCAGGACGTCHaemophilusinfluenzaeRd

经同尾酶消化的DNA末端连接示意图5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’BamHI5’XXXXGGATCCXXXXXX3’3’XXXXCCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAGAXXXXXX5’BglII5’XXXXA

GATCTXXXXXX3’3’XXXXTCTAG

AXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’5’XXXXAGATCCXXXXXX3’3’XXXXTCTAGGXXXXXX5’BamHIBglII

推测酶切割位点出现的频率对于推断DNA酶切片段大小很有用。假定4种核苷酸在DNA分子上出现的频率相同，那么靶序列为6个核苷酸的内切酶在每46（=4096）个核苷酸中酶切位点就有一次出现机会。据此推算，一条49000bp长的DNA中有12个6核苷酸识别序列的酶切位点（49000/4096）。但事实上并非真正如此，因为DNA分子中4种碱基的出现频率并不均等。识别位点在DNA分子上出现的频率一个踪蝶酶活期单位（U）指：在理灭想的霞反应球条件澡（适区宜的群缓冲恳液和困反应寺温度削，通溜常为37梨℃）下中，50L反应易体系望中完狸全降杨解1恒g糟誓D额NA所需纳要的柱酶量奔。影响焦酶活膜性的速因素圣很多酬，最阻重要复的有猾：A。DN鼻A的纯准度和时甲基刻化程蓄度B。甘油振的含思量（往不超目过5%）C。反应肌体系挽中的输离子仓强度D。反应使体系虑的pH值F。反应述的温蚊度条洽件（通敢常为37菜℃）酶单鸦位的丢定义挖和影钥响酶啊活性蒙的因赤素Bu考ff受er草(考10X)害2.屑0LWa震te搂r她1堤6.桃5LDN躁A兰1呜.0LEn海zy恩me担0.运5LVo丙lu纹me剩20据.0L4、限忠制性飞核酸啊内切等酶的映消化淋反应酶踪蝶切服反假应衬的扣基糟本赛步窝骤＋－电泳紫外您分析37呈℃弄1h加反假应液CKMBu轧ff中er伪(品10X)揉2.范0LWa顶te略r换1纠6.盘5LDN衰A泳1.下0L（1g/L）En缴zy宁me粪0.猪5LVo嚷lu骡me减20直.0L1.统0k涛b1.屯0k海b0.赞4k兄b0.字5k流b0.归6k周bCKMTT限制活性核竿酸内枯切酶错的应待用用于鹅转基松因后怕转化躲子的抬鉴定用于辟分子失标记岁（RF让LP）分峰析遗朴传多淡样性用于露构建杨基因荐库（Ge层no粪me表w康al捎ke您r）1、DN载A连接付酶作害用的角特点2、DN唐A连接雕酶的凡反应专条件3、DN拼A连接勾的策太略二DN杯A连接康酶及肾其应络用DN谈A连接拦酶的睡发现环形DN顷A分子突的发娘现使螺科学秧家相望信一区定有掘一种扰能连武接这帆种Ni您ck的酶湿存在吵。19餐67年，承世界郑上几撤个实刃验室而几乎仿同时扬发现污了一芳种能贺够催易化在2条DN漂A链之渐间形岭成磷酸夕二酯坟键的酶——DN丑A连接盼酶（li偶ga蛾se）。DN将A连接疗酶由大害肠杆旋菌基路因组DN含A编码叔，以NA烘D+作为嗽能源吃辅助进因子；T4思DN轨A连接刑酶由大叠肠杆垄菌T4噬菌愈体DN塑A编码耳，以AT存P作为载能源赵辅助龄因子现。（19好70年）副容胜易制域备，满而且欺可以抬连接果完全守配对送的平朱末端DN仰A分子祖，所以在交基因只克隆听中应普用广伯泛。NickNick1、DN粗A连接耽酶作苗用的蝴特点DN损A连接扯酶作若用的额特点A.连接幼的两门条链骄必须痛分别穷具有3′端自布由羟桂基（-O括H）和5迈′端磷咽酸基属团（-P），岸而且壤只有狸这两绍个基遮团彼此相亏邻时怀才能初进行秋连接闷反应拆；B.在羟栽基和躬磷酸盈基团键间形拥成磷邪酸二谊酯键扑是一榴种耗盐能过程，宁因此机连接毯反应类必须粗有能寄量分臂子的甘参与录，通找常有两种妖能量闯分子贼，即AT苦P和NA痒D+。OKNO连接城酶的腾酶活绒单位垃（U）：缺以T4客D托NA连接补酶命梦名，屿在最罪佳的横缓冲漠体系件及15捡℃、1h之内恢，在10软~1既5μ武L反应孙体系承中完美全连踩接1μ天g疏λD煤NA的Hi匹nd订Ⅲ片段层所需略的酶破量，世称为1U。载体裤去磷辰防止览自连各的应虚用示障例POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH连接梳酶连接党酶连接证酶碱性四磷酸芦酶2P誓i寄主惯修复赴缺口载体屑自连你或产大生二经具体泡等2.山DN视A连接奸反应命的条峰件连接信反应哭最佳减温度鞋为37平℃，但抚是此样时粘教性末缘瑞端间舒氢键垫结合罩不够叶稳定融，而裹且酶舍活性熊也会践迅速切降低音。比邮如，Ec罩oR朽I粘性唯末端选连接院部位奸只有4个碱说基对咸，很径容易猫断开周。所钱以通常菊在4-断15纺℃连接活。影响宴连接荒效率弹的因航素有船：A.温度匠（最谎主要隙的因砖素）B.谨A等TP的浓奶度(第1M意-训1悦0五M)C.连接游酶浓浮度（由平末唤端较面粘性箩末端拉要求六高）D.反应上时间晌（通每常连呀接过掠夜）E.插入忘片段潮和载此体片惹段的摩鄙尔比转化4℃过夜加反应液CK-重组菌落CK+粘性部末端DN瞧A片段截的连抢接NickNick3、DN盈A连接霜的策汉略平末裹端DN坟A片段脏的末民端加施尾连尽接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’AAAAA3’3’5’5’TTTTDN崖A聚合倒酶和T4视DN碍A连接买酶平末捏端DN乏A片段量加接固头连弄接法衔接配物(l受in绣ke省r)，也悼叫接锋头，是由杰人工弯化学肥合成配的一胳段10骗-1秘2个核错苷酸蔽的DN集A双链缝，其号中包拜含有1个或托几个婚限制距性酶犁切位邻点。后使用只时只爽须将码衔接刺物和托目的嘴片段愿的5′端用恭多核崇苷酸础激酶淋处理籍使之殖磷酸湿化，对然后友用T4烦DN樱A连接陈酶进涝行连梁接，疑就可贿获得行能产洗生粘盛性末受端的DN哭A片段炭。CC舟GA亲AT浊TC卵GGGG虹CT请TA侧AG担CC磷酸到化CC捡GA宗AT呀TC眨GGGG删CT胜TA摇AG肺CCPOHOHPPPOHOHT4连接才酶CC柜GA疏AT扰TC况GGGG岗CT诉TA仰AG耍CCPOHPOHEc陆oR锤ICC芬GA识AT瞒TC剧GGGG没CT寨TA能AG跑CCAA玻TT诞CG且GGC爷CCC蛇GGG纳CT收TA扁A当不端同的膨酶产娃生的和黏性振末端摇不能拉互补静配对控时如甚何连槽接？连接厅酶的同应用DN漫A的重箱组加接傍合适存的接匠头第一宣节凤基精因操咱作的伤工具喝酶一死限门制性煮核酸房诚内切翼酶及夏其应醉用二DN启A连接气酶及似其应巧用三DN味A聚合妹酶及叼其应竖用四乎修染饰性唯工具化酶Ge耻ne然ti旬c历en腥gi茄ne疼er厚in抖g诞is滔l圈ar扎ge仙ly洪a菊n授ex鸦er污ci厅se陶i刑n响ca加re午fu浪ll持y落co净nt负ro蹲ll桨ed扒e肯nz驴ym窝ol父og凉y.戏A欢v厉ar耻ie评ty龄o怖f析en雁zy涨me习s掉fo图rm广t何he阿b朝as咸ic态t办oo鞭lk丽it痰o勤f巧th月e承ge坐ne粉ti陷c散en掘gi烘ne爪er返.1、大管肠杆挖菌DN倾A聚合点酶I2、Kl史en膨ow片段3、T4沟D宴NA聚合名酶4、逆欺转录拔酶（丸反转饥录酶做）三DN箩A聚合渡酶及顷其应路用大肠牙杆菌DN毯A聚合系酶I（E。Co斤liDN用A唐po移l疲I）是Ko习rn赢be按rg条A膛.暗19歉56年首盛先从坛大肠疮杆菌E。Co辆li细胞吸中分扫离出园来的弓。它或是一笋种多薯功能管性的信酶，奋包括3种不次同的咳酶活欺力：5′姿-萄3′聚合男酶活臣性以双欲链DN很A为模熟板，颂催化赞单核细苷酸榆结合士到引置物的3′认-O恩H末端活，并奋不断爷延伸业。5′捐-岛3′外切库酶活从性将双口链DN艰A中游曲离的5′末端斩逐个坚切去晋。3′续-饼5雷′外切牲酶活烧性将游绵离的隔双链集或单偏链DN锯A的3′端降厕解。义不过气对于聋双链兔的降境解可检被5′矮-3希′的多鸡聚活韵性所漂抑制昼。CC横GGG透CT贴AT逐CG福GACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCC再TCC江GA耕TA合GC瞧CTGG卵CT获AT修CG擦GACC点GA戚TA杂GC友CTGG奶CT颗ACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+CCGATAGCCTGGCTAPolI+Mg2+T大肠肿杆菌DN畅A聚合谜酶I的三叔种用鸦途A.制备乳高比绍活度僵的DN务A探针利用西其5′映3告′的外愿切酶翁活性惜及其织聚合每酶活扒性。B.用于DN沸A连接蜓后的未大缺秋口填少充利用5′征3它′的聚摊合酶挤活性险。C.用于DN登A的序剪列分头析利用5′哪3′的聚恰合酶套活性用。大肠设杆菌须聚合极酶I的应斗用示四例CC穗GA静TA科GC唉CTGG甜CT党AT兽CG刘GACCGATAGCCTGGCTATCGGAPolI+Mg2+切口惠平移(N添ic庄k洲tr项an肤sl弓at苏io姓n)CC仇GGG车CT蔬AT记CG贿GACCGGGCTATCGGAPolI+Mg2+ATAGCC瓶T1、大遵肠杆挂菌DN衬A聚合安酶I2、Kl疗en到ow片段3、T4评D界NA聚合膝酶4、逆枪转录嫁酶（路反转寄录酶毙）三DN控A聚合急酶及砖其应冬用Kl束en渗ow片段读的主盆要用椅途Kl胳en童ow片段大肠诵杆菌苹聚合折酶I全酶垫经枯草筹杆菌烘蛋白巴酶处理虚后产电生的惜大片世段酶妖分子率，它卧仍然舰有5′然3悬′的聚丹合酶神活性挡和3′5找′的核绩酸外殊切酶斯活性背，但庙失去早了5′辣3′的外木切酶劣活性锤。Kl尼en争ow片段的主反要用崖途修补稻限制懂性酶哭消化DN叶A形成新的3′隐蔽挠末端标记DN是A片段健的末念端cD闻NA克隆骡中第株二链cD舒NA的合需成DN县A序列嫌的测毛定GAACT泻TA伞A1、大脆肠杆杜菌DN抖A聚合倚酶I2、Kl困en繁ow片段3、T4、T7栏D孙NA聚合倚酶4、逆逝转录桐酶（熊反转姑录酶庸）三DN倡A聚合煮酶及配其应礼用T4、T7俗DN顷A聚合颠酶的耻特点T4房诚D也NA聚合犹酶是从T4噬菌拦体感程染了掠的大泡肠杆伞菌中检分离乘出来刑的，桂它和大肠占杆菌拨聚合容酶I一样具有5′渣3蛙′的聚电合酶胆活性点、5′盈3士′的外薪切酶杠活性票和3撕′寒5只′的核钥酸外主切酶摊活性欺。其外编切酶锈活性答要比轻大肠府杆菌次聚合昨酶I的活胸性高20展0倍。T7顽D欢NA聚合闲酶是从T7噬菌阔体感蛇染了栽的大副肠杆嫂菌中疗分离萌出来版的，T7何D藏NA聚合降酶是究所有DN绸A聚合仔酶中陪持垦续合场成能亚力最维强的把一种归酶，其3获′考5四′的核旧酸外阵切酶容活性去是Kl倦en拌ow索D础NA聚合仓酶的10粱00倍。T7麻D顾NA聚合舒酶可内以替闪代T4条D否NA聚合禾酶的桨功能泻并能躲用于书大片委断的废扩增旺。T4四D骆NA聚合诞酶的轿用途1、以设填充摇反应急标记坝有5′端延元伸的节双链DN堤A片段获；2、以配取代赤反应解标记适延伸预末端葵或平黎头末乌端的双顿链DN滚A片段践；3、用暂于DN搬A序列蓄分析黄；耐热悟的DN释A聚合雪酶耐热掀的DN灵A聚合黄酶是舅在高愧温下之具有澡活性善的DN撑A聚合悄酶，楼来自铸嗜高响温的蹦细菌谅主要起用于PC捕R反应共，如Ta绝q国DN母A聚合鹿酶、Pf执u个DN另A聚合蚁酶等泰。1、大峡肠杆肾菌DN失A聚合薯酶I2、Kl膝en种ow片段3、T4残D疗NA聚合胶酶4、逆改转录杆酶（偷反转主录酶晌）三DN王A聚合锈酶及纲其应霸用逆转哲录酶—R竭ev甲er湖se世t边ra重ns塌cr炊ip停ta顷se逆转膊录酶王是一种扶可以委有效净地将mR叔NA转录盗成为DN模A的酶踢，其炎产物羞称为cD艳NA虏(挺co肝mp植le淹me蠢nt狗ar冰y再DN店A)换.实际果上，愁它也总是一草种RN洋A依赖举的DN嫩A聚合艇酶。逆转服录酶顾首先违是19西70年从搏鼠白掩血病菌毒和朽劳氏槽肉瘤银病毒透中发梅现的虚。这两聪个课绳题组顾的论盲文都皮发在款了同蜂一期塘的《N矿at生ur杆e》杂志距上。主要脊用途趣是将mR巷NA转录虏成cD以NA以制鄙备基恨因片批段。3’收A害AA鸡AA漆AA厅AAAAAAAAA5’TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA

第一嫩节芹基扮因操戒作的究工具谋酶一驾限淋制性晒核酸砖内切摧酶及辛其应阿用二DN捷A连接咬酶及倾其应混用三DN处A聚合扁酶及帮其应辛用四馋修念饰性飞工具短酶Ge塑ne窗ti锋c奖en扬gi放ne僵er排in报g梦is例l订ar荷ge斧ly量a我n袋ex教er卸ci验se刺i趟n忆ca致re温fu窃ll急y葛co货nt驼ro葵ll笑ed涌e油nz稍ym灶ol迈og想y.堂A鞠v斗ar芝ie法ty野o恐f神en休zy丹me坛s离fo票rm汪t体he佳b催as蕉ic厦t批oo描lk晋it愁o州f驱th雅e誓ge谜ne废ti各c赶en怨gi对ne鼓er激.1、末危端转括移酶齿（te渠rm帜in会al扭t敞ra捕ns智fe私ra稼se）2、核竹酸酶SI（SI芬n姨uc缸le某as是e）4、碱感性磷厚酸化庭酶四仰修趣饰性唯工具灰酶末端暴转移鹅酶的房诚特性末端残转移袄酶是道一类哈不依洒赖于DN漠A模板虑的DN叮A聚合宰酶。该类蹲酶可合以在额没有考模板催链存跟在的推情况傲下，烟将核播苷酸雾连接牲到DN光A的在3‘羟基竿，特莫别是系对于谊平末凡端的加双链DN胆A末端神加尾虚十分缴有效忧。最常顷见的孤用途丘是在药酶切灾产生报的平拍末端元加尾申以便哄于创群造粘基性的臣互补咸末端。平末辉端DN斯A片段蔬的末亭端加牧尾连才接法3’3’5’5’3’3’5’5’末端核苷酸转移酶+dATP+dTTP3’3’5’5’3’3’5’5’AAAAATTTTDNA聚合酶和T4DNA连接酶1、末显端转牙移酶默（te恐rm桨in捞al丈t别ra浙ns扮fe冰ra栋se）2、核平酸酶SI（SI跳n铺uc枝le养as祥e）3、碱苏性磷裳酸化盖酶（Al温ka爬li旺ne瞎p宰ho押sp膜ha奏ta缓se）四鲁修举饰性凝工具移酶核酸欣酶SI的特觉性这是盯一种钥从米警曲霉裹（As捎pe袖rg遇il观lu榜s换or排yz闪ae）中埋分离扇的可榴以降荣解单碌链DN施A或RN奔A的外霸切酶。其主自要用连途有（降画解单恩链核捡酸）A、在cD贿NA合成漂过程净中，累切开cD布NA的发董夹末慎端；B、载胳体构叠建过迁程中怖，切曲去DN据A片段呢的单莲链尾付巴，形成知平末隆端结壳构。3’悲A御AA拾AA慈AA诵AAAAAAAAA5’TTTTTTTTTAAAAAAAATTTTTTTTT5’TTTTTTTTT3’AAAAAAAA

发夹纵结构鞠的切赞除TTAAAATT单链梢尾巴侍的切硬除1、末题端转答移酶膛（te孟rm更in燃al妖t废ra生ns病fe内ra侧se）2、核筋酸酶SI（SI肤n减uc表le缸as限e）3、碱压性磷哄酸化火酶四姻修丘饰性架工具割酶碱性惊磷酸肌化酶锅的特戚性从细浆菌中俗分离邪的碱兼性磷椅酸化翁酶简避称BA书P（Ba伏ct有er珍ia纠l恳Al谅ka凤li揭ne凭P洁ho徐sp蒸ha急ta芦se），膜从小挤牛肠它中分骂离的培简称CA第P（Ca洋lf跳A迎lk顺al各in刃e吩Ph桂os棋ph涛at斤as将e）.其主钟要功泉能是运将DN诞A或RN倒A5氧′端的拖磷酸唤切除仔。其主具要用搜途有救：A、在灭用P标记DN别A恳5′端之胖前，纪去除5′端的视磷；B、在DN招A重组描技术遥中，姓去除DN摸A片段颤的5′磷酸菜，防止载预体的担自身市环化质。载体股去磷糖防止袜自连港的应陵用示董例POHPOHOHOHOHOHPOHPOHOHOHOHOH连接盯酶连接狡酶连接秀酶碱性管磷酸油酶2P揪i寄主则修复刊缺口载体防自连倘或产舟生二再具体乞等小罚结第一员节腔基佣因操巩作的努工具沿酶一单限活制性问核酸魂