浙江大学细胞培养绪论

PlatformTechnologiesofBiology生物技术平台的两根支柱：细胞培养技术&单克隆抗体技术细胞培养技术林旭瑷副教授

医学院病原生物学系林旭瑷：

办公室:医学院科研C817

电话:88208294

实验室:科研C804～810

E-mail:lxai122@163.com关于考试：

开卷，实验课结束前上交（10.26-10.27）

（A4纸张打印试题，手写答案附后）

10+40+50参考书谷鸿喜，张凤民，凌虹.细胞培养技术.北京大学医学出版社，2012章静波.组织和细胞培养技术.人民卫生出版社，2011谭玉珍.实用细胞培养技术.

高等教育出版社，2010一、绪论

二、细胞培养基础知识

培养前准备/培养基/培养设备

三、细胞培养基本技术

培养技术/培养物的固定、染色/显微镜观察

四、细胞培养中的细节问题内容组织培养的诞生与发展简史

组织培养的优缺点

组织培养常用术语

组织培养的实际意义

细胞系或细胞株的命名绪论细胞培养(cellculture)

从动物体内取出细胞或者组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术。细胞培养、组织培养和器官培养将活体的一小片组织放在盛有培养液的玻璃或塑料培养器皿中，待组织块粘着后，沿底面平面移动生长的过程。B、组织培养将组织块用机械方法或酶解法分离成单个细胞，做成细胞悬液，再培养于固体基质上，成单层细胞生长，或在培养液中呈悬浮状态培养的技术。A、细胞培养C、器官培养是指采取某些措施使器官的原基、器官的一部分或整个器官在体外存活、生长，并保持其原有结构和功能的培养技术。一、组织（细胞）培养发展史年鉴1878ClaudeBernard:证明一个器官的生理系统在个体死亡以后仍然可以人工维持。

1885WilhelmRoux:在一个生理溶液中维持一块鸡胚的活性并观察其发育，从而证实该发育与鸡胚的其他部分无关。1907RossHarrison:利用凝固的青蛙淋巴液作为培养基，在体外培养青蛙神经嵴，维持其活性达数星期，并观察到了神经纤维的生长，从而解决了神经纤维的来源问题。RossHarrison被人称为细胞培养之父。1910Burrows:率先在血浆凝块中长期培养鸡胚细胞。

1911Lewis:以海水、血清、胚胎提取物、盐和蛋白胨为原料配制成了第一个人工的细胞培养液，并观察到了单层细胞的有限生长。

1916Rous&Jones:开创用胰酶来收获贴壁生长的细胞。

1923-1931Carrel:研制T型培养瓶大规模培养细胞。1927Carrel&Rivera:制造了第一个病毒疫苗——牛痘疫苗。1933Gey:发明了转管培养细胞的技术。一、组织（细胞）培养发展史年鉴1948Fisher:研制成了第一个化学成分清楚的细胞培养液CMRL1006。1952Gey和同事:分离培养了HeLa细胞。1952Dulbecco:发明了噬斑法，用长满的单层细胞检测病毒。1954Abercrombie:观察到了体外培养细胞接触抑制的现象。1961Hatflick&Moorhead:发现人成纤维细胞在一定的代数之后会死亡。1965Ham:配制了第一个无血清培养液。1975KÖhler&Milstein:成功得到第一个用于单抗生产的杂交瘤细胞株。一、组织（细胞）培养发展史年鉴1.研究的对象是活细胞

能长时间、直接观察、研究活细胞的形态、结构、生命活动等二、细胞培养的优点2.研究条件可以人为控制

选择对象：均一性、重复性（类型/性质/阶段）调节条件：化学、物理、生物等因素条件研究方法：各种研究技术、记录方法3.研究的范围比较广泛

学科多：细胞学、免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、分子生物学等对象广：各种动物：低等动物--高等动物--人类

一种动物：不同年龄--

不同组织：正常或异常（肿瘤--）二、细胞培养的优点4.研究的费用相对较经济

可提供大量、同一时期、重复性好的、生物学性状相似的实验对象人工川所模魂拟的标条件与体内实际景情况孙仍不完碧全相钉同。当番细胞政被置边于体外绑培养后，阅生活乒在缺躺乏动趁态平宇衡的姐环境托中久鉴了，死必然发生哑变化。1.与体迁内主塌要不帝同相对孤立、单积一缺乏臭体内软的系统因作用毛、失润去神精经体竖液的饺调节吓和细跃胞相拜互间处的影响2.主要百表现失去霸原有丢组织逼结构漏和细喂胞形纳态著分化死减弱酬或不汪明显,细胞际趋向单一页化二、超细胞津培养门的缺境点对于逆体外鸣培养堂的细轮胞，放应该晒把他欧们视积作一逃种既港能保蹦持动洗物体惠内原细贺胞一莲定的昌性状接、结细构和嗽功能又具茄有某坛些改变楼的特仪定的手细胞垮群体，而他不能越将之雷与体户内的院细胞禾完全心等同娃。提刑示三、常用仗术语初代浓培养/原代梨培养尼（pr猎im阶ar匹y铅cu毅lt漠ur咐e）从直片接取液自生销物体咐细胞泄、组窃织或众器官弄开始渴的培敞养。桥初代胡培养末物一湿旦进饲行传代逝培养后，牛就成付为细胞运系。通常10代以怜内的赢培养尚物用坡作原脆代培辞养。--有限太细胞躁系（fi惭ni柏te绍c铜el姻l幅li甲ne）生存善期有孔限的谢细胞洋系，快不能侮继续漠传代芝或传管代数芳有限占。--连续葡细胞笛系或佩无限赢细胞镜系（in脚fi抽ni御te誉c旬el讽l虑li兰ne）获无遍限繁赞殖能率力能己持续至生存欣的细仁胞系榜，能衬连续秘传代问。传代折培养舍（su涨b-质cu家lt竟ur橡e）不论遍是否停稀释悲，在防体外查培养炭条件忠下，处将细裳胞从袋一个筋培养策器皿迎转移坝至另饲一培辜养器图皿。贴壁喝培养乔（a此nc锤ho京ra懂ge绝-d侍ep升en瓶de绕nt宜c槽ul汇tu刃re冰）细胞肃或培颈养物要只有激贴附赛于不改起化抵学作灶用的宪物体事（玻载璃或幸塑料述等无垫活性腰物体毕）的朝表面地时才姿能生章长、杨生存班或维净持功沃能。不能各表明档细胞益属于们正常杨或恶扁性转撤化悬浮惧培养星（s辨us姥pe滚ns亡io塘n辞cu有lt仿ur彼e）细胞笔或细告胞聚翼集体凶悬浮矮于液算体培樱养基鼓中增返殖的喜一种捎培养款方式份。淋巴包细胞盆、血武液肿终瘤细染胞等细胞雀株（巷ce杨ll鼓s魂tr哪ai营n）通过像筛选食或克障隆化队从原幻玉代培酬养物酒或细砖胞系撞中获寒得的戴具有蔬特殊卖性质倚或标枕志的摔细胞勾。这棵些特影性（则有一刑定的盟标记将染色控体、坏特殊抬的抗单原性耗等）晃在以洗后的缝培养渠中必缴须持愧续存掩在。--皂有桨限细缠胞株锹（f物in印it祥e及ce源ll香l碑in秆e）生存青期有晒限的泊细胞岔株。幸不能解继续抛传代拢或传谋代数负有限--丛连遵续细容胞株究或无邮限细罢胞株默（i零nf亿in宏it烧e潮ce俘ll漏l猾in么e）已获蚁无限烈繁殖忧能力穿能持柜续生猜存的常细胞耳株。杜能连绿续传象代。亚株厘（s散ub链st摆ra板in晴）由原赵细胞鉴株进分一步谷分离吩培养坐出与蛇原株磨性状汇有一燃定不悉同的孔细胞史群二倍宗体细饼胞系泪或株细胞预群染招色体锻数目松具有弃与原家供体货二倍漏体细灾胞染惯色体芹数相桌同或鼠基本戴相同季（2捧n细新胞占卖75低％以登上）渡的细饭胞群怜。在正炒常情摧况下弦具有国限生沉命期呈，属食有限储细胞客系。随供罩体年坑龄和挥组织拨来源念的不拔同，拔寿命着长短允各异倒。--藏-盆人胚哪肺成往纤维箩细胞基可传躬40福-6哲0代--森-吃人胚航肾细戏胞只称有8规-1绞0代--疑-佣人胚晶神经栗胶质字细胞腾15息-3拒0代为保痕持二耽倍体棍细胞线能长迎期被喇利用漫，一慕般在可初代营或2漏-5傅代即脚大量侧冻存崇作为原种武（s慌to葵ck告c震el倦ls蝇），用时单再进爱行繁址殖，壤用后思再继若续冻刷存，躬可供稍长期遭使用盲或延秃缓细透胞的港衰老刚。假二赚倍体柜：仅数卸目相死同，珍而核霉型不雪同，清即染炊色体胜形态评有改还变者膊。遗传鸦缺陷匹细胞歼系或忽株从有先天面遗传趣缺陷者取敌材（脊主要雅为成遍纤维猛细胞闪）培群养的奖细胞骆，或除用人工方热法诱穗发突随变的细酸胞，赤都属芬遗传性缺陷困细胞赏。这类缺细胞德可能亮具有袄二倍搏体核册型，眯也可榆呈异跪倍体味。肿瘤揉细胞仅系或芳株是现柳有细小胞系警或细扇胞株逆中最坦多的左一类刊，我业国已浪建细逗胞系倾主要宁为这稳类细份胞。半肿瘤驴细胞目系由丘癌瘤铺建成剥，多碧呈类属上皮费型细效胞，拾常已括传几掠十代找或百限代以旦上，报并具矿有不死辣性和异体辨接种言致瘤佩性。细胞甩凋亡撇（a贡po拉pt拜os因is批）细胞供内死户亡程鹅序的境开启山而导蛇致细冒胞自日杀的甘过程劝。与机魄体正胶常发络育、饰形态接形成寒、消茅除多锐余细虽胞等茎生理裤过程男密切把相关幅。主要戚形态肃特征涉为细匀胞皱讯缩、殃染色绢质聚坟集与们周边蠢化，丹以及怪凋亡侧小体宽的形兽成。AT捎CC新（A咽me谊ri连ca点n摔ty墙pe滤c铁ul脚tu芳re眼c男ol例le拿ct去io薄n）美国午模式锻培养施物收缠集中旺心/抹美国扎菌种好保藏曾中心戏。除收喉集细北菌、蹈病毒颜外，习还保陶藏有粗大量脚的细剂胞株粉（系谱）。体外态转化科（i遣n匹vi耳tr敌o台tr钓an首sf香or狸ma艺ti晋on盾）细胞雨在体辞外培牢养过贪程中育发生桃与原晨代细献胞形订态、匆抗原星、增缺殖或猎其它刚特性棍的可深遗传捆的变烟化，攻但不道具有离致瘤烘性。汇合兆（c己on菊fl步ue偷nc偿e）在瓶扬中培努养的善细胞丽彼此仔汇合喜形成涝单层妖。细胞常融合绵（c蓬el她l剃fu泽si繁on啦）在体攀外培赵养条河件下序，经爸化学服试剂千（P雄EG穴）、颈病毒捏（灭介活仙胆台病计毒）迈或物雁理方达法（孔电脉匪冲）驴诱发剃，使吩不同扶种的孤体细源胞融脾合产匹生杂弄交细性胞。细胞已周期谅（c擦el棒l叠cy孤cl吵e）细胞稿从前栋一次厉分裂莲结束袍开始身至本饥次分盆裂结增束所经经历暗的时壁相过茄程。读DN央A合峰成期巾（S鹿期）咸、有另丝分乱裂期播（M尸期）息、有递丝分代裂完臭成至宁DN坛A合尤成开示始的逮间隙书期（轮G1汽期）监、D个NA延复制阔结束何至有异丝分最裂开研始的具间隙蛾期（即G2舰期）尚。群体棕倍增应时间岭（p鉴op凯ul前at朝io常n恐do皮ub供li运ng沈t前im科e）在对划数生足长期臂进行扰计算之的细拜胞增尊加一逮倍所妄需的碑时间俊。细胞霉代时亦（c德el哀l或ge戚ne梁ra馒ti字on丢t均im部e）单个议细胞垮两次哪连续流分裂烘的时境间间珠隔。群体箱密度隶（p游op顿ul隶at浴io隆n弊de粱ns赵it两y）培养更器皿剩内，押每单吐位面猜积或毁体积欲中的煌细胞铅数，园多用订细胞持数/污cm2表示片。接触缝抑制逢（c客on微ta爪ct磨i躬nh香ib们it辱io府n）当一衡个贴科壁生阶长的溪体外拼正常做细胞婆生长董至与台另一畜个细支胞表吨面相遍互接描触时旨，便吃停止布了分蹈裂增吸殖，骨虽然矿相互害紧密佣接触搬，但毫不形焰成交援叉重侮叠生称长，盖也不白再进碧入S央期。饱和姨密度喘（s健at疏ur调at剃io唤n桑de弟ns僵it援y）在特奖定条敌件下科，培俗养皿史内能矿达到捉的最罪高细治胞数落，当孩细胞戏达到扒饱和船密度冤后细惰胞群按体停杜止繁枪殖，卖贴壁膀培养顶：细浓胞数震/c搭m2；悬图浮培摧养：汇细胞费数/阁cm3。分子永生物革学生物咬工程临床袍诊断和治梯疗生物里制品药物元开发四、胃细胞习培养漫的现拒实意狗义单克忽隆抗劈燕体制兄备过部程多莉克隆闪猴对已货建成内的各流种细杂胞系坏或细懒胞株群习惯应上都稠给以茅名称开；细嚷胞的喇命名芦无严坊格统许一规盟定，挣大多快采用距有一转定意免义缩砍写字药或代记号表颤示。质但不伸论什饲么形讲式，取均不芳宜太棍长，错以便悠记忆丑和了层解He伟La渡：为秘供体钞患者鸟的性激名(剑来源怨于宫唱颈癌捏)CH才O：若中国从地鼠裁卵巢兰细胞引(C叶hi痰ne难se辉H隙am抛st悄er资O拣va翼ry财)宫—则74蒙3：乔宫颈悬癌上症皮细愤胞，若19僵74率年3薄月建捆立NI部H3垂T3视；美研国国目立卫堂生研倦究所连(N遍at躺io鸡na测l嫩In徐st的it塑ut姜e竞of宝H沸ea容lt菠h)席建立秆,胸每3僚天传而代一基次，晨每次绳接种叨3×化106ce估ll停/m划l。五、细剖胞系抖或细泪胞株昨的命蛋名已建许立细找胞系湿或株键的签碍定、碌管理享和使减用培轨养鼻简信历劳：组织举来源贿日期购、物主种、翠组织桑起源辫、性摊别、牧年龄垮、供体晓正常氧或异目常健寇康状票态、握细胞尺已传照代数松等。冻袖存尝液：培养自基和臂防冻俭液名散称。细差胞酷活舍力投：融解鸭前后手细胞下接种宽存活甩率和科生长定特性端。培晚养园液：培养伏基种腐类和瞒名称雁(一室般要送求不辟含抗色生素原)，桃血清来村源和亚含量骡。AT坟CC奔（A拨me渠ri吃