农杆菌感受态细胞的制备与转化

DNACaCl2处理而诱导CaCl2溶液中，0℃下处理便会使细菌细胞膜温冰柜，分光光度计，接种针，10ml50ml1.5ml二、材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株20mMCaCl2，高压灭菌。1LBA44043mlYEB（Rif50mg/l）培养至OD600为0.5；内使用，或液氮中速冻在低温下，外源DNA（质粒）可吸附到感受态细胞表面，诱导细胞吸收DNA。（加入热激原理）转化了质粒DNA的农杆菌随后28℃恢复培养，可使质粒上携带的编码抗生LBA4404（EHA105）pCAMBAI1300+SPRYEB（Kan抗性）YEB50℃时加入卡那霉素（Kan）和（Rif），至终浓度分别为100µg/ml和50µg/ml，混匀后立即倒入培养皿，凝固后4℃倒置保存。冻5min；50µg/mlRifYEB经改造的Ti质粒（只含有帮助T-DNA跳到植物上的Vir区）存在杆菌工程菌株中，含有T-DNA的双元载体（BinoryVectors）完成重组后可以在大肠杆菌中扩增，提取质粒DNA是基于DNA不质粒DNA的变性不复性的差异而使其分离。当细胞在NaOH和SDS溶液中裂解时，在pH高达12.6的碱性条件下，蛋白质和DNA冲液时，质粒DNA恢复原来的构型，而DNA丌能复性，形成缠绕的网状结构，通过离心，DNA、蛋白质-SDS复合物随细胞碎片等沉淀下来，质粒DNA则留在上清MgSO4·7H2O0.5g，pH7.0，高压灭菌。溶液Ⅰ：50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris-HCl10mmol/LEDTA（pH8.0），高压灭菌（6.895×104Pa），4℃保存溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH，1％SDS0.4MNaOH（灭菌）2％SDS，用前等体积混合。溶液Ⅲ：3mol/LNaAc/KAc（pH4.8）10HAc11.5ml水乙醇、RNaseA挑取一个单菌落接种于3ml含相应抗生素的YEB（50mg/LKm）液体培养基中，1.5ml1.5ml，10000rpm30sec（8）12000g10min400μl70%乙醇，12000g8min，（9）10µl20µg/mlRNaseATEDNA，37°C50-100v0.5-1hr)+烟草生根培养基：MS)+的升6-8min，无菌水冲洗5遍，无菌滤纸吸干水分6mm（5－从平板上挑取单菌落，接种到20mL附加相应抗生素（卡那霉素）的YEB液体培养基中，在恒温摇，于28℃下以180r/min培养至OD600为0.6~0.8（约需17h）。OD6000.6~0.81%~2YEB右，待OD600为0.2~0.5时即可用于转化。培养2~4天。 点击进入淘宝生物实验，细胞、分子生物学、蛋白检测技术实验，约7G大小，22本套实验制作耗资上百万，由专业的影视和后期制作团队拍摄+生物、医学领域的教授专家指导+Thermo、Roche等著名企业参与共同制作完成。分子生物学实验技术共6个，包括:DNA甲基化检测、分子克隆技术、高分辨溶解曲线HRMQPCR位杂交（ISH。（ELISAblotting（IHC（ChIP细胞检测技术共10个，