上海市临检中心 PCR培训班 临床分子诊断方法学验证要求

临床分子诊断方法学验证要求关

明复旦大学附属华山医院检验医学科主要内容•

什么是验证？自建项目？商业化项目？•

如何做验证？步骤和实施路径•

举例说明JAK2

V617F突变方法的建立分子诊断面临的挑战•

涉及方法较多，如PCR、荧光定量PCR、MLPA、测序等；•

实验步骤较多，包括标本的分离保存、处理、检测；•

手工程度较高，自动化程度普遍偏低，较多依赖手工，不同的实验室条件和操作者等因素对实验结果的影响较大；•

尚未建立公认的质量管理标准等；•

更高的准确性要求；•

结果报告缺乏标准化；•

……这些基地将为个体化医学相关检测工作制定国家行业标准，并面向相关从业人员展开规范化、标准化的培训工作，为我国个体化医学研究与应用提供宝贵经验，大大加快我国分子诊断的进程。CONTENTS•

SUMMARYOF

CHANGES•

UNDERSTANDING

THE2010CAP

ACCREDITATION

CHECKLIST

COMPONENTS•

HOWTOINSPECTUSING

R.O.A.DINSP•

ADDITIONAL

INFORMATION•

APPLICABILITY•

PROFICIENCYTESTING•

QUALITY

MANAGEMENTAND

QUALITYGENERALISSUESPROCEDUREMANUALASSAYVALIDATIONREQUISITIONSSPECIMEN

HANDLINGSPECIMEN

PROCESSINGQUANTITATIVEASSAYS:

CALIBRAREAGENTSCONTROLSANALYSISExtractionAmplificationRestriction

EndonucleasesSequencingDetectionMethodsAgaroseandPolyacrylamReal-Time

PolymeraseCh“Verification”和“Validation”Verification(确认）“通过提供客观证据证明特定的要求已得到满足”•

当已经存在合适的性能参数时候，有必要明确在实验室内新的试验符合参数规定，这个过程叫确认。•

正确地做某个试验（

thetestisbeing

performed

correctly）.•

其他确认的应用包括：采用某个实验室已经建立的技术开展新试验（为一个新的基因测序）；或者开展某个已经在其他实验室验证过试验。“Verification”和“Validation”Validation(验证)“通过提供客观证据证明预期的使用或应用要求已得到满足”•

当没有合适的性能参数可供参考时需要验证。•

与”金标准“和参考试验相比较去评估性能•

做正确的试验（performingthe

correcttest)•

在医学分子诊断领域，由于往往缺乏参考方法或者参考物质，通常将最可靠的方法作为标准。不同认可体系对方法学验证的要求•

CAP的“方法学验证（assay

validation）”和ISO15189中的“诊断性验证（diagnostic

validation）”•

共同点：新的检测方法应用到病人临床诊断之前必须进行方法学验证，以了解该检测的临床表现，保证实验结果可信度[1-3]。•

CAP提出了明确的要求：“实验室必须进行分析验证各项检测的性能参数”，还对验证试验覆盖的标本范围（如不同的基因型等）、标本类型（如血液、尿液、新鲜/冷冻组织、石蜡包埋组织等）、验证的参数（如参考值、报告范围、准确度、分析灵敏度、分析特异性和精确度等）做了相应的规定。[1]GuzelO,GunerEI.ISO

15189

accreditation:Requirementsforqualityandcompetence

ofmedical

laboratories,experience

ofa

laboratoryI.ClinBiochem,2009,42:

274-278.[6]Yanikkaya-Demirel

G.ISO

15189

accreditation:

Requirementsforqualityandcompetence

ofmedical

laboratories,experience

ofa

laboratoryII.ClinBiochem,2009,42:

279-283.[7]Jennings

L,VanDV,GulleyML.Recommended

principlesandpractices

forvalidatingclinicalmolecular

pathology

tests.ArchPathol

LabMed,2009,133:

743-755.方法学验证的要求的修正和改进IVDs.AndLDTs.•

Invitrodiagnostics(IVDs):商业化生产试剂盒；通过FDA510(k)

clearanceorPMA(premarketapproval)。•

Laboratory-developedtests(LDTs):

自建项目；局限于实验室内使用。•

ManyoftheseclinicallyimportantLDTsareunlikelytoeverbecomeFDAclearedorapprovedbecauselow

test

volumesmakeiteconomicallyunfeasibletogothroughtheFDA

cleared:

In

vitro

diagnostics

that

have

gone

through

and

passed

a

510(k)

trial.FDA

approved:

AnIVDthat

has

gone

through

and

passed

aPMA

trial.510(k)

trials

are

designed

to

show

that

an

IVDissubstantially

equivalent

to

alegally

marketedpredicate

device.

510(k)

trials

are

less

involved

and

less

expensive

than

PMA

trials.•••currentFDA510(k)

or

PMAapprovalprocess.•Premarket

approval

trials

are

required

for

class

III

medical

devices

or

ifthere

isno

predicate

deviceavailable

for

comparison.

They

are

significantly

more

expensive

to

perform

than

510(k)

trials.Verification/确认试验•

使用范围：主要用于商业化试剂盒（in

vitro

diagnostics，IVDs）项目，指已经商业化生产，并已经通过美国FDA510(k)

clearance

或approval过程的分子诊断项目。•

主要目的：确证厂家提供的数据在本实验室的的实际效果•

主要指标：准确性、精确性、参考范围和可报告范围（这些指标通常在厂商的说明书中提及）。PARR(precision,accuracy,reportablerange,andreferencerange).Validation/验证试验•

使用范围：自建项目（LDTs）和修改项目

（modifiedFDA-cleared/approvedtests）•

主要目的：验证本试验在临床使用的各项性能指标及其实际效果•

主要指标：准确性、精确性、参考范围和可以接受范围（与确证实验要求相同）分析敏感性、分析特异性（验证试验要求）其他涉及的重要的评价指标（标本稳定性、干扰物质、线性……）（验证试验要求）•

与确诊试验相比相对复杂PARR+AS+AS(precision,accuracy,reportablerange,referencerange,analyticsensitivity,andanalyticspecificity)和其他涉及的重要的临床评价指标Clinical

validity/临床验证•

主要包括：临床敏感性（clinical

sensitivity）和临床特异性（clinicalspecificity)

。•

临床敏感性不同于分析敏感性：分析敏感性主要指参考方法检测结果为阳性的结果中，用实验方法得到阳性结果的一致性（对定性试验来说）；临床敏感性主要指结果为真阳性的人群中真正罹患某种疾病或异常的比例，强调实验结果与临床诊断的一致性。•

临床特异性也不同于分析特异性：分析特异性主要指参考方法检测结果为阴性的结果中，用实验方法得到阴性结果的一致性（对定性试验来说）；临床特异性主要指实验结果为阴性的人群中真正没有罹患某种疾病或异常的比例，也强调实验结果与临床诊断的一致性。如果是定量实验，则分析敏感性的定义接近于最低检测浓度的概念。•

某些罕见的疾病，由于阳性病例的数量有限，实验室进行临床敏感性评价存有一定难度，这时可以引用文献报道的临床敏感性和特异性作为理论支撑。•

临床特异性：正常对照容易收集，故容易实现。实施具体路径指南？•

CAP还是ISO15189都没有提供医学分子诊断验证试验的具体细节

。•

临床实验室标准化委员会（Clinical

and

LaboratoryStandardsInstitute,CLSI）的EP文件就对实验室的分子诊断的方法学验证做出了说明

。•

临床分子诊断的欧洲标准化工作组Eurogentest也建立了一些相应的指南。开展新试验验证确认定义性能参数：准确性、缺点、质量控制与现有的性能规范作比较持续的验证与性能规范比较、审计方法学验证的基本步骤•

第一步:

方法学验证设计阶段•

第二步:

具体实施，搜集数据阶段•

第三步：补充和完善阶段第一步:

方法学验证设计阶段运筹于帷幄之中，决胜于千里之外！主要内容•

查阅相关文献，包括文献报道以及相关疾病的临床诊治指南等，对该检测的技术背景进行分析；•

明确项目的用途；•

选择实验的对照方法；•

具体的实验步骤、检测的位点（如可能的突变类型）；•

阈值的选择；•

质控标本的选择（阳性标本、阴性对照等)；•

验证试验的临床标本类型以及采集拒收原则；•

实验室对现仪器和试剂的需求和损耗的评估；•

总的试验和手工处理的时间的评估；•

试剂储备的评估；•

其他技术准入的评估等。--For

anFDA-approved

test：•

相对简单•

阐明检测的应用范围以及预期观察的指标--ForanLDT

ormodifiedFDA-approved

test：•

相对复杂•

临床应用价值（临床采用该检测的价值和危险）•

临床指征（尽可能涵盖所有适合采用该检测的临床指征）•

仔细评价文献报道决定临床使用价值：特别是当实验室对该检测知之甚少或者在临床诊断实践中缺乏足够先例

。其他因素----分析前和分析后因素•

检测目的

(如筛选、诊断、预后、预测、监测、确诊……）•

标本类型

(全血、血清、血浆、尿液…..)•

标本采集和处理程序•

拒收原则•

目标人群•

结果评价•

……----和临床医生的沟通（特别可能会采用该试验的临床医生）•

决定临床是否感兴趣并准备开展•

决定试验结果如何影响病人诊疗•

保证试验方法的选择来满足检测目的•

……----临床方面：•

错误的结果对病人可能造成的危险•

快速TAT时间的要求（特别是该试验时间对病人的诊断治疗产生关键性作用时）•

是否有确认试验•

……-----实验室方面：•

对现仪器和试剂的需求和损耗的评估•

总的试验和手工处理的时间的评估•

试剂储备的评估•

其他技术准入的评估•

质控品的评估•

……第二步:

具体实施，搜集数据阶段定性确认实验PARR(precision,accuracy,reportablerange,andreferencerange).•

准确性：与参考方法的阳性和阴性一致性•

精确性：即重复性，同一些样本的反复检测（批内、批间、不同检测者之间，不同仪器之间等）•

一系列的临床标本，尽可能覆盖可报告范围，和对比方法（如测序等）比对结果。•

或者用另一个通过验证过程的实验室的标本进行对比结果。•

CLSI（EP12-A35)推荐至少在10-20天内检测

50个阳性标本和50个阴性标本。其中一些标本还用来计算重复性。定量确认实验•

准确性PARR•

分析检测范围•

可报告范围•

线性(EP6-A)•

最低检测限(EP17-A)•

最低定量限•

干扰物质

(EP7-A2)•

……(precision,accuracy,reportablerange,

andreferencerange).定性验证实验•

基本方法同定性确证实验•

干扰物质评价•

临床表现评价：----诊断已知的情况下，检测的结果可以直接用于计算临床敏感性和特异性，以及其他一些参数

。----诊断未知的情况下，可通过文献报道和其他外延的方式（如chartreviews

）实现。PARR+AS+AS(precision,accuracy,reportablerange,referencerange,analyticsensitivity,andanalyticspecificity)定量验证实验•

基本方法同定量确证实验•

干扰物质•

延长检测天数至20天，以便于获得双倍的数据用于分析

(符合EP5-A238和EP09-A237的最低要求)。•

尚未包括其他的参数，如临床敏感性和特异性,可通过文献报道和其他外延的方式（如chartreviews

）。PARR+AS+AS(precision,accuracy,reportablerange,referencerange,analyticsensitivity,andanalyticspecificity)‘‘确证/验证实验中，究竟多少的标本能满足实验的需求?’’Itdepends

！第三步:

补充阶段补充内容

Checklist•

验证总结完成交主任审核同意•

生物安全内容的更新•

标准操作规程的撰写和审核•

必要的worksheets的撰写和审核•

培训计划更新•

员工操作培训•

员工岗位职责的补充•

仪器维护的日程更新（如有必要）•

新仪器的性能验证（如有必要）•

信息系统的项目更新•

标本接收流程的更新•

标本拒收标准的更新•

临床医生的告知•

能力验证实验的计划•

……验证的持续性•

当某个新试验通过验证，开始在临床使用——这不是性能评估的终点。•

验证中的性能参数应被用来评估每批试验的有效性，每隔一段时间，这些信息可以用来加入验证档案。•

许多时候，数据的积累是最初验证数据的重要的组成部分，可以用来持续性评估监测的准确性和质量。•

持续性的验证可以包括室内质控，外部室间质评和有关该试验结果不一致性。什么时候需要进行方法学验证？•

新项目开展之前；•

新增或者变更原有项目的检测仪器；•

更换不同厂商提供的试剂；•

同一检测项目在不同仪器检测结果需要修正时等等。•

不同的验证目的所观察的性能指标各有不同，•

以新项目开展之前的方法学验证最为重要且全面。•

为了确保在临床检测的过程中的分析性能稳定、准确、可靠、可追溯，从而保证检测结果的有效性。新方法的建立新仪器使用之前更换不同的试剂荧光PCR结合熔解曲线法检测JAK2V617F突变方法的建立及其方法学验证背景介绍•

有多个国内外研究课题组证实，JAK2

V617F（Val617Phe）1849G>T点突变存在于95%的真性红细胞增多症（PV）患者、50%～60%的原发性血小板增多症（ET）以及原发性骨髓纤维化（PMF）患者体内。•

2008年世界卫生组织将JAK2V617F突变纳入了PV、PT和PMF的诊断标准。•

JAK2

V617F

突变检测已经成为诊断BCR-ABL阴性骨髓增殖性肿瘤（MPN）的主要分子标志物。2008

WorldHealthOrganization

DiagnosticCriteriaforPolycythemiaVera真性红细胞增多症的诊断标准2008WorldHealthOrganizationDiagnosticCriteria

forEssential

Thrombocythemia原发性血小板增多症诊断标准2008

WorldHealthOrganizationDiagnosticCriteriaforPrimaryMyelofibrosis原发性骨髓纤维化的诊断标准检测手段•

测序法：金标准，费时费力•

荧光PCR结合熔解曲线法[1]：快速、高效，无商业化临床试剂盒。•

为了满足临床需求，在将荧光PCR结合熔解曲线法应用到患者临床诊断之前，必须要进行方法学验证，即验证实验（validation）[2]。••参考文献：1.张心菊，顾小叶，刘双春等

采用荧光定量PCR检测JAK2基因V617F突变

中华检验医学杂志2009年5月第32卷第5期583-586.•2.

关明，刘维薇

CAP和ISO15189认可对临床分子诊断方法学验证的要求

中华检验杂志2013年2月第36卷第二期105-107.验证实验•

对象：华山医院血液科门诊或住院患者中确诊的MPN患者57例。其中PV患者33例（外周血31例，骨髓2例），PT患者17例（外周血15例，骨髓2例），骨髓纤维化患者7例（外周血6例，骨髓1例）。同时收录对照组51例健康人。标本的选择中涵盖了5份骨髓液及52份外周血。•

质控标本的选择：人红白血病HEL细胞作为纯合突变型（TT）人结肠癌SW480细胞作为野生型（GG）将两者混合得到的标本作为杂合型（GT）验证实验•

实验方法

:荧光定量PCR结合熔解温度反应方法设计4条引物针对JAK2野生型和突变型DNA片段。由于野生型和突变型的碱基序列迥异，使得这两个片段的熔解温度（Tm)不同。通过对野生型和突变型不同的特异Tm峰就可以判断JAK2

V617F基因型。•

无突变标本在（75.2±0.2）℃处有1个特异Tm峰，有JAK2V617F突变的标本则在（76.8±0.2）℃处有1个特异Tm峰（见图）。•

通过突变型和野生型之间不同Tm值的峰图可以判断JAK2V617F的基因型。53验证实验•

主要评价指标：PARR+AS+ASPARR：精确性（precision）准确性（accuracy）参考范围（reference

range）可报告范围（reportable

range）AS:分析敏感性（analytic

sensitivity）AS:分析特异性（analytic

specificity）54准确性•

使用荧光PCR结合熔解曲线法检测的标本同时送第三方测序公司（上海生物工程技术公司）测序。两者结果进行比较。55试验方法与测序法的一致性比较（例）荧光PCR结合测序法（参考方法）合计熔解曲线法突变型野生型合计2503282957293225•

使用Kappa值衡量两方法之间的一致性。•

结果：Kappa=0.89，说明两方法之间具有非常好的一致性。56精确性•

批内重复性•

批间重复性•

不同仪器之间平行实验•

不同人员•

不同批次合成的引物•

结果：符合率100％57参考值以及可报告范围的建立•

报告结果为：“突变型”或“野生型”•

正常参考值为：“野生型”•

报告结果的解释:检出JAK2

V617F突变型需要结合血常规、EPO等一系列检测帮助诊断一类