上海市临检中心 PCR培训课件 14.NIPT实验室检测及质量控制（徐晨明）

NIPT实验室检测及质量控制徐晨明上海交通大学医学院附属国际和平妇幼保健院NIPT介绍检测技术流程检测质量控制质量控制指标传统产前筛查

一组生化、超声指标的组合评估，预测不良妊娠的风险（21三体、18三体、开放性神经管缺陷）孕周检测手段检出率假阳率超声，颈后透明带82-87%5%11-13+6周扫描

(NTscan)传统筛查方法

(Non-invasive)孕周检测手段检出率假阳率15–

20血清学筛查(Quad

screen)81%5%甲胎蛋白(AFP)绒毛膜促性腺激素(hCG)游离雌三醇

(uE3)抑制素A(InhibinA)同时结合孕妇的预产期、体重、年龄和采血时的孕周综合评估计算风险值无创产前基因检测

Non-invasive

Prenatal

Testing

1997,胎儿游离DNA被发现

2003,人类基因组计划完成

2005,二代测序技术

(NGS)

突破针对外周血中游离DNA直接进行的无创产前基因筛查，近年来快速发展游离DNA发展史1947年外周血中发现游离DNA2011年NIPT1997年胎儿游离DNA的发现临床应用1987年恶性肿瘤患者血浆中分离出游离2007年NIPT方法学的建立DNA（cf-DNA）将提取到的血浆／血清的DNA，用Y染色体特异性引物扩增，扩增后的产物凝胶电泳后观察条带。13、14号为男性基因组，阳性对照，15号为未怀孕女性基因组，16号为阴性对照。可见怀孕的女性血浆里可以检测到男性胎儿的DNA胎儿游离DNA特点来源：

胎儿细胞通过胎盘渗透到母血中，被母体免疫系统破坏，胎儿DNA残留下来；

胎儿细胞凋亡；

胎盘滋养层细胞凋亡。基本特点：

含量有一定的变化规律。妊娠第5周开始可检测到胎儿游离DNA，随着孕周增加而增加，但存在个体差异；

分娩后短时间内消失，平均半衰期为16.3min，2h后无法检出；

DNA片段较小，平均166bp左右。Am.

J.

Hum.Genet.62:768–775,

1998不同的人的胎儿的浓度有个体的差异，但总体是随孕周的增加而增加基于二代平台的NIPT技术TargetedSequencingMassivelyParallelShotgun

SequencingTargetedSequencingNateraPanorama®SequenomMaterniT21TMIlluminaVerifi®BerryBAMBNITMBGINIFTYTMAriosaHarmonyTMCOUNTINGSNPs

定量法通过全基因组测序或目标捕获测序来检测母血中目标染色体在基因组中的比例是升高或降低，通过统计学方法对胎儿染色体非整倍体进行评判

SNP法则通过分析母亲、父亲基因组和母血染色体中11000多个SNP位点的基因型和不同allele之间的比例，建立数学模型，并通过生物信息学方法计算概率，判断胎儿非整倍体是否存在。部分文献报道的NIPT对21三体的产前检测论文阳性阴性Sensitivity

SpecificityChiuet

al(BMJ

2011)Sehnert

et

al(ClinChem

2011)Ehrich

etal(AJOG

2011)Palomaki

etal(Genet

Med

2011)Lau

et

al

(JMFNM

2012)Bianchi

et

al(OG

2012)8613392121131434100%100%100%98.6%100%100%100%100%100%100%100%100%97.9%100%99.7%99.8%100%100%100%100%99.9%100%99.9%100%410147176893650818404Sparks

et

al(AJOG)123Ashoor

et

al(AJOG

2012)Norton

et

al(AJOG

2012)Nicolaides

et

al(AJOG

2012)Danet

al(Prenat

Diag2012)Gilet

al(UOG2013)297288819391096297314311与传统产前筛查相比

cfDNA没有漏检T21，而传统方法漏检20%

降低了100倍的假阳性率

cfDNA在包括低危人群的整个人群中的检测效率同样好

T18和T13的假阳性率（0.01%和0.02%）极低NIPS可取代传统筛查成为一线筛查技术Thefollowingprotocoloptionsarecurrentlyconsideredappropriate:

cfDNAscreeningasaprimarytestofferedtoallpregnantwomen.Thereisnowincreasingevidencetoshowthatthetestingcanalsobeappliedtowomenwithaveragerisk.“可以将NIPT技术作为一线筛查提供给所有的孕妇。”“越来越多的证据显示该项检测也可以提供给普通风险人群。”——国际产前诊断学会（ISPD）2015年最新立场声明BennP,BorrellA,ChiuRWK,etal.PositionstatementfromtheChromosomeAbnormalityScreeningCommitteeonbehalfofthe

BoardoftheInternational

SocietyforPrenatalDiagnosis[J].Prenataldiagnosis,2015,35(8):725-734.检测技术流程检测技术流程样本信息采集数据分析样本接收上机测序跟踪回访血浆分离DNA提取QC文库检测文库构建报告生成和发放血浆分离&DNA提取一步离心的缺陷全血4℃，1600g离心10min，取上清血浆转速过低，游离DNA分离效率差出来过高的又会造成细胞破裂增加背景血浆4℃，16000g离心10min，取上清血浆文库构建文库构建的目的是在需要测序的片段两端加上能够与测序仪配合的接头序列，以进行后续的测序常规步骤：基因组DNA抽提---超声片段化DNA---DNA片段末端补平----；游离DNA:直接通过末端修复获得两端平齐的DNA不同的测序平台加接头的方式会有差异

如果是illumian的测序仪测序，末端修复后要通过在末端加个“A”碱基后再加接头（因为illumian的接头是末端是带一个突出的“T”碱基），proton测序仪测序，末端修复后直接加接头。

在加接头的过程中可以加入标签，也可在pcr的过程再加入标签（一段长6～8bp、序列已知的短链DNA）从而产生一个可用于区分不同样品的唯一编码，测序结束后，通过软件分析和筛选，即可从混合测序的结果中获得每个不同样品的测序结果。QC文库检测文库质量检测常用的检测仪：QPCR定量检测仪：对文库的浓度定量准确，如果测序仪对浓度的容忍度低建议使用此定量方法，但是不能检测片段长度。建议配合片段长度检测仪一起使用。2100/2200生物分析仪：既可以检测文库的浓度又可以检测文库的片段长度。但文库浓度定量没有QPCR定量准确。如果测序仪对浓度的容忍高建议使用此定量方法。2100检测仪7500荧光定量PCR仪Qubit浓度检测仪Qubit浓度检测仪：对文库的浓度定量，浓度误差大，成本较前两种低。如果是熟练稳定的建库同时测序仪对浓度的容忍度高的，可以使用此种方法。QC文库检测

Hiseq

2000、Hiseq2500、Hiseq4000、Hiseq

x10等对上机浓度容忍度低的测序仪建议要用QPCR定量仪定量

对于小RNA建库，外显子捕获测序，全基因组测序的文库建议要用2100/2200来确定建库后文库片段的大小

由于血浆游离DNA本来就是小片段的DNA，而且proton对上机的浓度的容忍度比较高，所以无创建库样本可以直接用qubit进行定量。SBS测序技术上机测序SBS测序技术通过桥式PCR的方式对文库进行扩增，扩增后样本通过测序过程中加入的碱基所带的荧光的不同，经拍照记录颜色的不同来判断碱基的差异。上机测序半导体测序半导体测序是通过模板珠实现，而模板珠是落入刚好能容纳一个珠子的微孔中进行反应的。测序时聚合酶进行聚合反应，期间每一个反应阶段加入一种碱基，一旦加入的碱基可以进行聚合反应，即释放出氢离子，使孔槽内的PH值产生变化数据分析以21-三体为例，假设：100DNA单位

/毫升血浆。其中,95个单位来源于母亲,

5个单位来源于胎儿通过大规模并行测序,获得分布在每条染色体上的真实的核酸片段数量,经过计数与比较:

正常胎儿或者

21-三体胎儿报告生成和发放报告内容：21,18,13三体风险评估建议：“高风险”的孕妇，须进一步进行产前诊断，“低风险”的孕妇，需进行后续随诊。《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范》检测质量控制检测前唯一标识、申请检测的项目临床信息检测申请样本采集采样前准备、采集信息收集（日期、样本类型）、采血管、样本体积≥5mL血浆：干冰、

cell

free

DNA采血管样本运输及保存标本接收全血

：常温接收标准、拒收；不合格样本的记录检测申请适用人群不适用人群孕周<12＋0周血清学筛查显示胎儿常见染色体非整倍体风险值介于高风险切割值与1/1000之间的孕妇夫妇一方有明确染色体异常1年内接受过异体输血、移植手术、异体细胞治疗等有介入性产前诊断禁忌证者（如先兆流产、发热、出血倾向、慢性病原体感染活动期、孕妇Rh阴性血型等）胎儿超声检查提示有结构异常须进行产前诊断有基因遗传病家族史或提示胎儿罹患基因病高风险孕期合并恶性肿瘤孕20+6周以上，错过血清学筛查最佳时间，但要求评估21三体综合征、18三体综合征、13三体综合征风险者医师认为有明显影响结果准确性的其他情形注：本标准选自卫计委《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范》检测申请慎用人群有下列情形的孕妇进行检测时，检测准确性有一定程度下降，检出效果尚不明确；或按有关规定应建议其进行产前诊断的情形。包括：（一）早、中孕期产前筛查高风险。（二）预产期年龄≥35岁。（三）重度肥胖（体重指数>40）。（四）通过体外受精——胚胎移植方式受孕。（五）有染色体异常胎儿分娩史，但除外夫妇染色体异常的情形。（六）双胎及多胎妊娠。（七）医师认为可能影响结果准确性的其他情形。注：本标准选自卫计委《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断技术规范》样本采集编号要同采血管上一致采血管类型按照无菌操作要求，采取孕妇外周静脉血应当仔细询问孕妇基本情况、孕产史、本次妊娠情况、既往史和家族史等，如实、准确、详细填写检测申请单EDTA管采样体积≧5mlCellfreeDNA管样本运输及保存样本体积样本类型运输条件备注4℃下条件暂存，必须离体8小时内4℃条件下进行血浆分离。母体全血（EDTA管）5-10mL4℃采血管或送检单上标记抽血日期及时间。全血离体72小时内

4℃条件下进行血浆分离。母体全血（cell

freeDNA

采血管）5-10mL6-35℃环境下常温运输血浆分离后短期（一周内）可以在﹣20℃冰箱暂存，长期-80

℃条件保存；禁止将样本置于室温下放置，避免反复冻融。血浆≧2mL干冰标本接收标本拒收情况标本采集不当，如抗凝剂使用不正确、容器使用不正确、严重溶血或有血凝块、采血管破裂或开盖、标本标识不清等标本未按照规定的温度、时限等保存和运输检测申请单填写不完整溶血正常溶血血浆分离时须根据溶血情况对血浆进行质控，将血浆分为正常、微溶血、中度溶血、重度溶血，溶血样本由于有核细胞破裂，使母体基因组DNA释放到血浆，造成cffDNA的比例含量下降，影响检测结果的准确性，因此溶血样本需要重抽血。检测中每个标本有效数据量、唯一比对序列数目等均应当符合试剂说明书要求

；EDTA：8hCellfreeDNA：72h血浆标本-70℃以下保存检测质量合格的标本应当严格按照产品说明书进行实验室结果判读文库构建上机测序血浆分离DNA提取文库质控信息分析防止混样及DNA污染文库的片段大小和浓度要符合试剂说明书要求DNA提取和文库构建的过程中可以加入阴阳性对照来监测实验过程的污染和最后的数据质量文库质控文库构建完成后须根据文库浓度和文库片段大小和分布对文库质量进行质控，不合格的文库重新构建半导体测序法文库的质控标准：2100定量质控图

主峰片段大小在245—265bp左右；引物二聚体、接头二聚体浓度低于主峰浓度的5%及无拖尾现象；文库最低浓度不应低于0.1ng/ul

主峰片段大小300bp左右（因为illumian平台的接头大小和半导体测序法有差异所以和半引物和接头二聚体污染导体的主峰大小有差异），在120bp无明显引物二聚体，次峰（500bp）不能高于主峰高度的1/3；文库浓度要大于1.4nmol文库质控次峰过高

建议检查血浆是否溶血，溶血的情况常常会出现次峰过高的的情况

如有溶血建议重新采血，如无溶血建议重新建库引物和接头二聚体峰过高

建议重新纯化文库，然后再检测看纯化结果，一般经过纯化可以去除引物污染上机测序质控测序完成后根据测序结果对测序做一个质控，合格的结果进行数据分析，不合格的结果重新测序SBS测序法测序结果质控：半导体测序法测序结果质控：Template

QC:Mean

Read

Length:

>100bpSequencing

QC:Total

Reads：Key

Signal：>60M>50PF（通过质控的cluster概率）>80%Q30（质量值大于或等于错误率为0.1%以下的碱基所占比值）>80%Key

signal:模板平均信号强度，可以反映乳化pcr的效果数据分析质控数据分析过程中会对数据进行质控，合格的出报告，不合格的重新测序或者重新文库构建信息分析DataUsableDataAnalysisResult数据测序质控数据In-Run质控数据分析质控测序质控质控指标Flow统计单位Run说明Flow标准260测序数Nomatch(M)Bases(G)meanLenQ20(%)Run[0,4]未能拆分到样品所剩下的比对序列条数样品原始比对序列碱基数SampleSampleSampleSample[0.20,2][100,125][75,88.5][5,15]样品比对序列的平均长度比对序列测序质量大于

的碱基占比20PCT(%)样品拆分比率数据In-Run质控质控指标UR_Mean(M)GC_Gap(%)统计单位说明标准>3RunRunRunRunRunRunRunRun样品唯一比对序列条数的均值和

碱基含量波动范围G

C[0,2]Fraction_Mean(%)Dup_Mean(%)Female_NumChr13_CV_RateChr18_CV_RateChr21_CV_Rate[7,15]样品的胎儿浓度的均值重复序列占总比均值女胎样品个数<16.8[2,8]131821号染色体的相对

值CV[0.97,1.10][0.96,1.06][1.04,1.18]号染色体的相对

值CVCV号染色体的相对

值数据分析质控质控指标统计单位说明标准[-1,1][-1,1][-1,1][0.8,1.2][0.8,1.2][0.9,1.3]>5Chr13_T_meanChr18_T_meanChr21_T_meanChr13_CV_RateChr18_CV_RateChr21_CV_RateChr13_RF_NumChr18_RF_NumChr21_RF_NumRun131821号染色体

值均值TRun号染色体

值均值TRunT号染色体

值均值样品

号染色体相对

值范围SampleSampleSampleSampleSampleSample13CVCV样品

号染色体相对

值范围1821样品

号染色体相对

值范围CV样品

号染色体参考数13样品

号染色体参考数18样品

号染色体参考数>521>5实验室环境要求无创产前检测PCR实验室分区及各区的环境要求紫外灯分

区主

要

功

能温

度湿

度

压

差试剂准备区18-27℃30-70%+15PA试剂准备、储存与分装标本与文库制备区血浆分离与提取，文库构建18-27℃30-70%+5PA必需文库扩增与检测区文库扩增、质检与混合18-27℃30-70%-（pooling）5PA-15PA20-25℃40-60%测序区测序检测有明确的分区，各个区要有独立的通风和空气系统，在实验室里物品和人员要单一流向。仪器及设备使用仪器及设备维护状态标识确认正常