第五章基因工程育种微生物遗传育种(与“基因”有关的文档共65张)

第五章基因工程育种微生物遗传育种第一页，共65页。2奠定基因工程的三项关键技术DNA的特异切割

Smith和Nathans获1978年诺贝尔医学奖DNA的分子克隆

Berg（1972）将猴病毒SV40DNA与λ噬菌体基因融合，成功构建重组DNA；

Cohen和Boyer（1973）将质粒pSC101与R的tetrkmr基因融合，并将重组DNA转化E.coli，首次实现了DNA的分子克隆。DNA的快速测序

Sanger(1975)的酶法、Gilbert(1977)的化学法DNA快速测序技术

1980年诺贝尔化学奖：Berg,Gilbert,Sanger第二页，共65页。3分离或合成基因；通过体外重组将基因插入载体；将重组DNA导入细胞；扩增克隆的基因；筛选重组体克隆；对克隆的基因进行鉴定或测序；控制外源基因的表达；得到基因产物或转基因动物、转基因植物基因工程操作的主要步骤第三页，共65页。4第一节基因克隆的酶学基础一、限制性核酸内切酶restrictiveendonuclease核酸酶：通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的酶。核糖核酸酶(RNase)与脱氧核糖核酸酶(DNase)核酸外切酶：exonuclease核酸内切酶：endonuclease第四页，共65页。51、寄主控制的限制与修饰作用（1）寄主控制的限制作用(Restriction)作用：破坏外源DNA，使之迅速降解机制：限制性核酸内切酶，识别特定的碱基序列并进行切割（2）寄主控制的修饰作用(Modification)作用：保护自身的DNA，使之不受限制机制：甲基化酶，催化S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移到限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。第五页，共65页。62、限制性核酸内切酶的类型特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型功能限制、修饰限制限制、修饰蛋白质结构3种不同亚基单一成分2种不同亚基所需辅助因子ATP,Mg2+,SAMMg2+ATP,Mg2+,SAM识别序列EcoB:TGA(N)8TGCT4~8bp,旋转对称EcoPI:AGACC切割位点距识别位点至少1000kb处随机切割在识别序列内（或附近）距识别位点3’-端24~26bp处第六页，共65页。73、限制性核酸内切酶的命名用产生菌的属名一个字母(大写，斜体)＋种名两个字母(小写，斜体)[＋菌株名一个字母]＋编号（罗马数字）[例]EcoRI,EcoRII：从E.coli

Rye13菌株中获得HindI，HindII，HindIII：从Haemophilusinfluenzae

d菌株获得第七页，共65页。84、Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特征（1）识别序列：一般4~8bp，具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构(palindromicstructure)例：AluI：5’-AGCT-3’

AsuI：5’-GGNCC-3’

PstI：5’-CTGCAG-3’第八页，共65页。9（2）切割：产生平末端：SmaI5’-CCC↓GGG-3’3’-GGG↑CCC-5’产生3’-OH单链粘性末端:PstI5’-CTGCA↓G-3’3’-G↑ACGTC-5’产生5’-P单链粘性末端:EcoRI5’-G↓AATTC-3’3’-CTTAA↑G-5’第九页，共65页。10第十页，共65页。11酶剪切条件需要镁离子的存在，特定的酸碱度和离子强度。辅助条件：DTT、牛血清蛋白。抑制因子：杂蛋白、酚、氯仿、乙醇、EDTA、 SDS、高盐浓度。其它：甘油浓度等可以改变对序列的识别。第十一页，共65页。12狭义：来源不同但识别和切割相同序列的酶。

HpaⅡ与MspI:CCGG广义：来源于不同物种但能识别相同DNA序列的限制性内切酶，切割位点可以相同也可以不同异功酶（neoschizomer）：SmaI和XmaI，它们均识别CCCGGG，但前者切后产生钝末端，后者切后产生粘性末端。（3）同裂酶(isoschizomers)第十二页，共65页。13

两种酶切割序列不完全相同，但却能产生相同的粘性末端，这类酶被称为同尾酶

BamHI:G↓GATCCBglⅡ：T↓GATCA（4）同尾酶(isoocaudamer)第十三页，共65页。14二、DNA连接酶（DNAligase）

催化两个双链DNA片段相邻的5’-P与3’-OH之间形成磷酸二酯键。1、体外DNA连接连接具有互补粘性末端的DNA片段连接具有平末端的DNA片段先在DNA片段末端加上人工接头，使其形成粘性末端，再行连接第十四页，共65页。152、连接用酶（1）T4DNA连接酶：催化反应需要Mg+2,ATP催化粘性末端连接，效率较高催化平末端连接（2）大肠杆菌连接酶催化反应需要NAD+只能催化粘性末端的连接第十五页，共65页。16减少载体自身连接的方法：脱磷酸；双酶切第十六页，共65页。17三、反转录酶(reversetranscriptase)催化以mRNA为模板的cDNA的合成cDNA（complementaryDNA）：互补于mRNA的DNA片段内含子外显子

DNA↓转录前体mRNA↓修饰成熟mRNA第十七页，共65页。18Reversetranscription第十八页，共65页。19四、末端转移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase)催化将脱氧核苷酸连接至DNA分子末端的3’-OH上向3’-单链末端上连接：Mg+2向平末端上连接：Co+2五、TaqDNA聚合酶来源：栖热水生菌Thermusaquaticus第十九页，共65页。20第二节基因的克隆载体(cloningvector)克隆载体：以繁殖DNA片段为目的的载体克隆载体的基本要求在细胞中能进行自主复制，为松弛型;具有多种限制酶的单一切割位点，便于外源DNA的插入，并且插入后不影响载体的复制;容易进入宿主细胞，进入效率越高越好，并且容易从宿主细胞中分离纯化出来，以便于重组操作;具有可供选择的遗传标记第二十页，共65页。21一、质粒载体1、质粒的一般生物学特性

(1)环状双链质粒DNA的构型共价闭合环状DNA(cccDNA):两条链均保持完整的环状构型，通常呈现超螺旋的SC构型开环DNA(ocDNA)：一条链保持完整的环状结构，另一条链出现有一至数个缺口，即OC构型线形DNA(lDNA)：质粒DNA经过适当的限制性核酸内切酶的切割后，发生双链断裂，称L构型第二十一页，共65页。22第二十二页，共65页。23(2)表型效应性别：F，SCP1抗生素类物质合成：SCP1，Col抗药性：R分解性质粒：CAM(樟脑)，TOL(甲苯)酶的合成：Rye13隐蔽性质粒(crypticplasmid)：2m第二十三页，共65页。24(3)质粒的分类分子量：大型质粒：MW>40×106d

小型质粒：MW<10×106d复制类型严紧型质粒(stringent)：1~3copies/cell

松弛型质粒(relaxed)：10~60,ormore第二十四页，共65页。25接合类型接合型质粒(conjugative)

非接合型质粒(nonconjugative)质粒的不亲和性(incompatibility)

在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞中稳定共存的现象。同一不亲和群：不能共存于同一细胞中不同的不亲和群：能共存于同一细胞中第二十五页，共65页。26(4)质粒的命名①质粒名以三个英文字母加阿拉伯数字表示

pUC19plasmid发现者或实验室名编号(小写）（大写）第二十六页，共65页。27②为了说明质粒的来源、性状，有时需要标出缺失、插入等pXY9109：FDtraA3(63.1-64.0kb)pXY2101：pXY101W4[0kb:k12hisA:1.5kb](5)与质粒有关的菌株的命名E.colik12:E.coliC600：k12(F-)(l-)thrleutonAlacYthiE.coliXY100：C600(F’155)(pXY1234)第二十七页，共65页。282、质粒克隆载体（1）特性具有独立复制起点;具有较小的相对分子量（1~200kb）,克隆外源DNA片段一般不超过15kb；具有较高的拷贝数（10~200）；具有便于选择的标记；易于导入细胞；具有安全性第二十八页，共65页。29（2）克隆质粒载体第二十九页，共65页。30第三十页，共65页。31质粒分离的步骤：粗提精提第三十一页，共65页。32氯化铯梯度离心法：有效地去除蛋白质、RNA、染色体DNA、受损质粒。第三十二页，共65页。33二、l噬菌体克隆载体1、优点遗传学背景十分清楚载体容量大，~23kb具有较高的感染效率2、类型插入型载体:较小片段DNA的插入（10kb以内）；取代型载体：较大片段DNA的插入；重组DNA分子大小为l噬菌体DNA的75～105％；野生型λDNA为48kb，λ噬菌体的包装上限是51kb。编码必要基因的DNA区段占28kb，因此λ载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb。第三十三页，共65页。34插入型载体第三十四页，共65页。35取代型载体第三十五页，共65页。363、l噬菌体克隆载体的导入转染：用λ重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。效率低：未经任何基因操作处理的新鲜制备的λDNA，其典型的转染效率也仅为105～106噬菌斑/微克λDNA，体外连接的结果，转染效率便下降到了104～103左右。λDNA的体外包装：在离体条件下，将重组体DNA包入噬菌体等病毒颗粒，形成有感染功能的病毒载体。第三十六页，共65页。37三、柯斯质粒载体(cosmidvector)

由l噬菌体的粘性末端和质粒构建而成。含有来自质粒的一个复制起点、抗药性标记、一个或多个限制酶单一位点，来自l噬菌体粘性末端的DNA片段（cos位点）。第三十七页，共65页。38优点具有l噬菌体的特性，在体外包装后具有噬菌体的高效感染力；具有质粒DNA的复制方式；具有克隆大片段外源DNA的能力(45kb)；具有与同源序列的质粒进行重组的能力第三十八页，共65页。39柯斯克隆（cosmidcloning）应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术第三十九页，共65页。40第三节基因工程的基本操作一、目的基因的获得1、从供体细胞的DNA中分离

（基因文库的构建）基因文库：某生物染色体基因组各DNA片段的克隆总体。如“鸟枪法”(ShotgunMethod)第四十页，共65页。41步骤提取染色体DNA限制酶解电泳分离与载体连接导入宿主筛选阳性克隆第四十一页，共65页。422、从mRNA合成cDNA(cDNA文库构建）所谓cDNA文库是指某生物体全部mRNA的cDNA克隆总体。第四十二页，共65页。43步骤提取mRNA反转录合成cDNA第一链合成cDNA第二链与载体连接导入宿主细胞筛选阳性克隆第四十三页，共65页。443、PCR体外扩增目的基因PCR（PolymeraseChainReaction）聚合酶链式反应：利用特殊的DNA聚合酶，在体外扩增位于两段已知序列之间的特定DNA区段的方法。(1)PCR组成：含目标DNA序列的模板DNA寡核苷酸引物DNA聚合酶：Taq或PfudNTPs缓冲体系和金属离子第四十四页，共65页。45(2)PCR过程变性(denaturation)：90℃以上退火(annealing)：40~60℃延伸(extension)：72℃

如此进行20~40个循环，DNA量扩增106~107倍。第四十五页，共65页。46第四十六页，共65页。47第四十七页，共65页。484、基因的化学合成主要应用于已知核苷酸序列的、分子量较小的基因的制备。通常先合成一定长度的具有特定序列的寡核苷酸片段，然后再组装成完整的基因。方法主要有：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法和自动化法等。第四十八页，共65页。49二、目的DNA与载体的连接1、粘性末端连接2、平齐末端连接3、同聚末端连接4、人工接头连接第四十九页，共65页。50三、重组DNA导入宿主细胞1、转化或转染2、体外包装与感染3、电穿孔法electroporation常用宿主系统第五十页，共65页。51过程：连接反应的混合液+感受态细胞;

冰浴10至30分钟;

热休克0.5至2分钟;

加入培养基37C振荡培养1小时;

涂布平板，培养。第五十一页，共65页。52四、重组体的筛选与鉴定1、遗传学方法：检测选择性标记2、核酸杂交方法：检测目的基因3、免疫化学方法：检测目的基因产物4、直接检出法：检测目的基因产物第五十二页，共65页。53五、DNA序列测定Sanger双脱氧链终止法1、试剂引物模板：待测序DNADNA聚合酶dNTPsddNTP第五十三页，共65页。542、测序反应3、制备聚丙烯酰胺凝胶3、凝胶加样4、电泳5、结果记录与分析第五十四页，共65页。55第五十五页，共65页。56第五十六页，共65页。57六、外源基因的表达影响表达的因素细胞中基因拷贝数：拷贝数多，产物多转录水平：启动子与RNA多聚酶的统一翻译水平：mRNA的核糖体结合部位与宿主核糖体的统一；密码子与tRNA的统一；mRNA的稳定性外源基因的插入方向转录后的修饰及翻译后的修饰第五十七页，共65页。58第四节基因工程的实际应用微生物发酵病毒疫苗哺乳动物蛋白（人源蛋白药物）转基因动植物环境生物技术基因诊断与基因治疗蛋白质工程（定点突变、定向进化）代谢工程第五十八页，共65页。59复习题1、何谓基因工程？基因工程操作主要步骤。2、何谓限制性核酸内切酶？Ⅱ型限制性核酸内切酶有何特点？3、克隆载体的基本要求。4、质粒的表型效应、分类、命名。5、目的基因的获得途径6、名词：基因文库、cDNA文库、PCR、质粒不亲和性第五十九页，共65页。60插入钝化/失活（insertionalinactivation)由于外源