生物化学与分子生物学第二十一章DNA重组及重组DNA技术

第8版生物化学与分子生物学第二十一章

DNA重组及重组DNA技术

GeneticRecombinationandGeneticEngineering主要内容2自然界的DNA的重组和基因转移13重组DNA技术在医学中的应用重组DNA技术2发生在同源序列间的重组，又称基本重组。是最基本的DNA重组方式，通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换。以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机制的Holliday模型。一、同源重组(homologousrecombination)第一节自然界的DNA的重组和基因转移3Holliday模型中，同源重组主要4个关键步骤①两个同源染色体DNA排列整齐②一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA对应的链连接，形成Holliday中间体③通过分支移动产生异源双链DNA④Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA，分别为：片段重组体(patchrecombinant)拼接重组体(splicerecombinant)4片段重组体

：

切开的链与原来断裂的是同一条链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。拼接重组体：

切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。5Holliday连接体Holliday连接体（Hollidayintermediate），RobinHolliday1964年发现Holliday连接体一旦形成就能进行重排，从而改变链的彼此关系，形成不同的构象，构象决定了在Holliday连接体拆分时是否发生重组。6

内切酶

(recBCD)DNA侵扰(recA)分支迁移

(recA)

内切酶(recBCD)

DNA

连接酶5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´3´3´5´3´5´3´3´5´5´3´5´3´5´3´Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´7Holiday中间体5´3´5´3´5´3´5´3´5´3´5´5´5´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´5´5´5´5´3´3´3´3´内切酶(RuvC)内切酶(RuvC)

DNA连接酶

DNA连接酶片段重组体拼接重组体8RecA右手螺旋的核蛋白细丝，6个围一圈重组酶Lehninger's.Principles.of.Biochemistry.4th9二、位点特异重组位点特异重组(site-specificrecombination)

是由整合酶催化，在两个DNA序列的特异位点间发生的整合λ噬菌体的DNA整合细菌的位点特异性重组免疫球蛋白基因重排10（一）λ噬菌体DNA的整合λ噬菌体的整合酶识别噬菌体和宿主染色体的特异靶位点发生选择性整合噬菌体重组位点attP，大肠杆菌重组位点attB，15bp核心序列整合酶Int、整合宿主因子IHF、Xis参与切除11特异的重组位点—附着位点细菌∽attB，由BOB’组成噬菌体∽attP，由POP’组成

O称为核心序列、B、P称为臂重组酶——λ整合酶（integrase，Int）非细菌重组所必需整合宿主因子（integrationhostfactor，IHF）Xis蛋白：改变DNA结构，使其对整合呈惰性参与切除反应噬菌体编码宿主编码整合反应12λ噬菌体的生活史溶菌生长途径(lysispathway)溶源菌生长途径(lysogenicpathway)13

H2鞭毛素阻遏蛋白Hin重组酶转位片段hinH2IH1

H1鞭毛素hinH2IDNA启动序列H1启动序列（二）细菌的特异位点重组鼠伤寒沙门氏菌H片段倒位决定鞭毛相转变14免疫球蛋白是具有抗原决定簇结合特异性的各种球蛋白分子的总称。多样性是免疫球蛋白的重要特性。自然界的抗原种类极多，每种抗原还有不同的抗原决定簇，因此具有多种特异性的免疫球蛋白分子的种类也必定是极其众多的，可以有几百万种。可是，脊椎动物基因组内所有的基因总共不过几万个左右。因此，决不可能有那么多的免疫球蛋白基因去编码每一种特定的免疫球蛋白分子。研究证是通过基因重排来实现免疫球蛋白的多样性。在胚胎细胞中，V、J、(D)和C基因是分散排列的，在B细胞发育成熟过程中，基因组中组成免疫球蛋白分子的各个基因开始发生重排，V区基因发生y—J或y—D—J重排，与C基因连接，转录产生mRNA。随机重排的结果可以产生108—10l0种免疫球蛋白分子。(三)免疫球蛋白基因的重排15免疫球蛋白基因的结构免疫球蛋白(Ig)，由两条轻链(L链)和两条重链(H链)组成，分别由三个独立的基因族编码，其中两个编码轻链(和)，一个编码重链。

轻链的基因片段：重链的基因片段：LVJCLVDJC16重链(IgH)基因的V-D-J重排和轻链(IgL)基因的V-J重排均发生在特异位点上。在V片段的下游，J片段的上游以及D片段的两侧均存在保守的重组信号序列(recombinationsignalsequence,RSS)。此重排的重组酶基因rag(recombinationactivatinggene)共有两个，分别产生蛋白质RAG1和RAG2。

CACAGTG(12/23)ACAAAAACCGTGTCCACTGTTTTTGG重组信号序列基因片段17免疫球蛋白基因重排过程18三、转座重组由插入序列和转座子介导的基因移位或重排称为转座(transposition)。可移动的序列单元：插入序列(insertionsequences,IS)转座子(transposons)19插入序列(insertionsequences,IS)组成：二个分离的反向重复(invertedrepeats,IR)序列特有的正向重复序列一个转座酶（transposase)编码基因

IRTransposaseGeneIR发生形式：保守性转座(conservativetransposition)复制性转座(duplicativetransposition)（一）插入序列转座20插入位点两端往往会出现重复序列Lehninger's.Principles.of.Biochemistry.4th21Lehninger's.Principles.of.Biochemistry.4th保守性转座复制性转座22转座子(transposons)——可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。

转座子组成：反向重复序列转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposaseGene有用基因（二）转座子转座23“转座子”先驱麦克林托克芭芭拉•麦克林托克81岁才获得诺贝尔生理或医学奖，成为遗传学研究领域第一位独立获得诺贝尔奖的女科学家。

巴巴拉·麦克林托克（BarbaraMcClintock，1902-1992）

麦克林托克理论的影响是非常深远的，她发现能跳动的控制因子，可以调控玉米籽粒颜色基因的活动，这是生物学史上首次提出的基因调控模型，对后来莫诺和雅可布等提出操纵子学说提供了启发。24

细菌的可流动性元件A插入序列：转座酶编码基因两侧连接反向末端重复序列(箭头所示)B转座子Tn3：含有转座酶、β-内酰胺酶及阻遏蛋白编码基因C转座子Tn10：含四环素抗性基因及两个相同的插入序列IS10L25由转座子介导的转座26四、原核细胞：接合、转化和转导（一）接合作用当细胞与细胞、或细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）的DNA转移称为接合作用(conjugation)。27可接合质粒如F因子(Ffactor)质粒——细菌染色体外的小型环状双链DNA分子28（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转化作用

(transformation)。

例：溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。2930（三）转导作用当病毒（噬菌体）从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（供体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用(transduction)。31基因重组技术

DNARecombinationTechnique32基因工程诞生的理论基础DNA是遗传物质肺炎双球菌转化实验1944年Avery，确定了基因的分子载体是DNA，而不是蛋白质噬菌体转染实验1952年AlfredHershy和MarshaChase进一步证明遗传物质是DNADNA双螺旋结构1953年JamesD.Watson和FrancisH.C.Crick揭示了DNA分子的双螺旋结构和半保留复制机制33基因工程诞生的理论基础中心法则和遗传密码1957年Crick又提出了遗传信息传递的“中心法则”1964年MarshallNirenberg和GobindKhorana等终于破译了64个遗传密码34基因工程诞生的技术突破限制性内切酶（restrictionenzymes）1970年H.O.Smith等分离出第一种限制性核酸内切酶。WernerArber理论预见限制酶DanielNathans用限制酶切得SV40DNA片断HamiltonO.Smith得到第一个限制酶1978年Nobel生理或医学奖35基因工程诞生的技术突破DNA连接酶（ligase）1967年5个实验室几乎同时发现了DNA连接酶。载体（vector）1972年前后使用小分子量的细菌质粒和噬菌体作载体。在细菌细胞里的大量扩增。感受态体系1970年M.Mandel和A.Higa发现经过氯化钙处理的大肠杆菌容易吸收噬菌体DNA。1972年S.Cohen发现这种处理过的细菌同样能吸收质粒DNA。36基因工程诞生的技术突破琼脂糖凝胶电泳1960s发明了琼脂糖凝胶电泳，可将不同长度的DNA分离开DNA测序技术1975年F.Sanger、A.Maxam和W.Gilbert发明了DNA快速测序技术1980年Nobel化学奖37基因工程的诞生Berg的开创性实验1972年斯坦福大学的PaulBerg小组完成了首次体外重组实验：将SV40的DNA片断与噬菌体的DNA片断连接起来（用DNA末端转移酶，而非限制性内切酶）1980年Nobel化学奖38基因工程的诞生Boyer-Cohen实验：第一次成功的基因克隆实验1973年斯坦福大学的S.Cohen小组将含有卡那霉素抗性基因的大肠杆菌R6-5质粒与含有四环素抗性基因的另一种大肠杆菌质粒pSC101连接成重组质粒，具有双重抗药性。后来又把非洲爪蟾核糖体基因片段同pSC101质粒重组，转化大肠杆菌，并在菌体内成功转录出相应的mRNA。39发明重组DNA技术开创生物工程时代StanleyCohen1986Nobel生理或医学奖(发现神经生长因子和表皮生长因子)

HerbBoyer

40基因工程的主要操作内容目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断重组体的制备将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上重组体的转化将重组体（载体）转入适当的受体细胞中克隆鉴定挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）目的基因表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物41本节主要内容

相关概念DNA克隆工具酶目的基因基因载体基本原理关键步骤与过程42一、重组DNA技术相关概念克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为克隆化(cloning)，即无性繁殖。（一）DNA克隆技术水平：

分子克隆(molecularclone)，即DNA克隆细胞克隆个体克隆（动物或植物）43重组DNA技术又称：分子克隆（molecularcloning）DNA克隆（DNAcloning）基因工程（geneticengineering）目的：①分离获得某一感兴趣的基因或DNA②获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）主要过程包括筛选44（二）工具酶限制性核酸内切酶

DNA聚合酶Ⅰ

逆转录酶

T4DNA连接酶碱性磷酸酶末端转移酶

TaqDNA聚合酶45重组DNA技术中常用的工具酶工具酶功能限制性核酸内切酶识别特异序列，切割DNADNA连接酶催化DNA中相邻的5´磷酸基和3´羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接DNA聚合酶Ⅰ合成双链cDNA分子或片段连接缺口平移制作高比活探针DNA序列分析填补3´末端Klenow片段又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的53聚合、35外切活性，而无53外切活性。常用于cDNA第二链合成，双链DNA3末端标记等反转录酶合成cDNA替代DNA聚合酶I进行填补，标记或DNA序列分析多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸5´羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶在3´羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基46限制性核酸内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶来源：原核生物功能：自我保护——细菌的限制和修饰系统（R/M体系）47限制（Restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片断。48修饰（Modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割49限制性内切酶的类型目前鉴定出三种不同类型的限制性内切酶：I型限制性内切酶II类限制性内切酶III类限制性内切酶50I型限制性内切酶Recognizesitecut1-1.5kb切割位点不确定：在距离特异性识别位点约1000-1500bp处随机切开一条单链。51II型限制性内切酶识别位点序列：未甲基化修饰的双链DNA上的特殊靶序列（多数是回文序列）。EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’PstI5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’

产生粘性末端EcoRV5’-GATATC-3’3’-CTATAG-5’

产生平齐末端5253II型限制性内切酶是应用最广泛的内切酶同裂酶（Isoschizomers)识别位点和切点完全相同HindIII5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’XmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

SmaI5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’

识别位点相同，但切点不同54识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端：如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’

BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’

5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’

BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。55III类限制性内切酶在完全肯定的位点切割DNA，但反应需要ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷蛋氨酸）。在基因工程操作中用途不大。EcoP1:AGACCEcoP15:CAGCAG56限制性内切酶的命名1973年H.OSmith和D.Nathans提议的命名系统，命名原则如下：用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。大肠杆菌（Escherichiacoli）用Eco表示；流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）用Hin表示用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok,EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoRI，EcoRV57第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。命名BamHI

属

系

株序bacillusamyloguefaciensH株淀粉化芽孢杆菌H株的第一种酶Hin

dⅢ

属

种

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血杆菌d株的第三种酶58影响限制性内切酶活性的因素DNA的纯度（DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA）DNA的甲基化程度（基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株）温度（大多数是37℃，少数要求40-65℃）缓冲液(Buffer)（购买的都配）MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度；Tris-HCl：维持pH；二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性；牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定；59DNA连接酶从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。DNA连接酶（ligase)的发现DNA复制滚环复制，D环复制，一定有断口。60DNAligase的特点两种DNA连接酶大肠杆菌连接酶只能连接粘性末端T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，还能连接平末端61连接反应的机理AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPiATP（NAD+)提供激活的AMPAMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP62DNA聚合酶基因工程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶KlenowfragmentT7DNA聚合酶T4DNA聚合酶修饰过的T7DNA聚合酶逆转录酶63常用DNA聚合酶的特性比较DNA聚合酶3’5’外切酶活性5’3’外切酶活性聚合速率持续能力大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高64T4多核苷酸激酶来源T4噬菌体的pseT基因编码。从T4感染大肠杆菌细胞中分离出来。多种哺乳动物细胞中也发现这种酶功能催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。不论5’-OH端突出与否655’

3’

HO--OH5’

3’

HO--OH3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

ATPT4多核苷酸激酶天然的DNA的5’端都是磷酸化的。（1）催化DNA的5’端磷酸化（用于连接反应）多核苷酸激酶的用途66交换反应标记法反应混合物中具有超量(-32P)ATP和ADP时，多核苷酸激酶能催化(-32P)ATP的-32P与DNA5’端的磷酸交换。3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

3’

32P--OH5’

3’

HO--32P5’

(-32P)ATP、ADP多核苷酸激酶反应效果不理想。多核苷酸激酶的用途（2）同位素标记DNA的5’端。67多核苷酸激酶的用途（2）同位素标记DNA的5’端。5’

3’

HO--OH5’

3’

HO--OH3’

32P--OH5’

3’

HO--32P5’

(-32P)ATP多核苷酸激酶3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

碱性磷酸酶正向反应（forwardreaction）68碱性磷酸酶碱性磷酸酶种类细菌性碱性磷酸酶（从大肠杆菌中分离出来，Bacterialalkalinephosphatase，BAP）有抗热性小牛肠碱性磷酸酶（从小牛肠中纯化出来，Calfintestinalalkalinephosphatase，CIP）SDS中加热68℃可完全失活69催化脱掉DNA（或RNA）5’端的磷酸根。3’

P--OH5’

3’

HO--P5’

5’

3’

HO--OH5’

3’

HO--OH碱性磷酸酶防止线性化的载体份子自我连接碱性磷酸酶的特性碱性磷酸酶的功能：70单一酶切口的载体的粘性末端容易自我连接AAGCTTTTCGAAHindⅢ酶切A-OHTTCGA-PP-AGCTTHO-A碱性磷酸酶5’

5’

5’

71A-OHTTCGA-OHHO-AGCTTHO-AOH与OH不能形成磷酸二酯键，所以不能自我连接。但同一酶切后的外源DNA的5’端有P，能与脱磷酸的载体OH连接。72ATTCGA

AGCTTAAGCTTA

ATTCGA

连接酶-OH与-OH连不住其中每条链上都有一个nick，但转入细菌后会被修复。3’

P-AGCTTA-OH5’

3’

HO-ATTCGA-P5’

外源DNA73（三）基因载体定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。常用载体质粒DNA噬菌体DNA病毒DNA74克隆载体(cloningvector)为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体称为克隆载体。表达载体(expressionvector)为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意设计的载体称为表达载体。75载体的应具备的特征：能自主复制，有复制起点；具有1个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源DNA。761.质粒

(plasmid)特点

能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。7778λ噬菌体DNA改造系统λgt系列（插入型，适用cDNA克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）2.噬菌体(phage)M13噬菌体DNA改造系统（含lacZ基因）M13mp系列pUC系列7980813.粘性质粒(cosmid)82酵母人工染色体

(yeastartificialchromosome,YAC)细菌人工染色体

(bacterialartificialchromosome,BAC)动物病毒DNA改造的载体（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）其他83（二）表达载体表达载体是指用来在宿主细胞中表达外源基因的载体。根据宿主细胞分为：原核表达载体真核表达载体841.原核表达载体

原核表达载体的基本组成

R：调节序列；P：启动子；SD：SD序列；TT：转录终止序列852.真核表达载体

酵母表达载体、昆虫表达载体、哺乳动物细胞表达载体

OriPro：原核复制起始序列；P：启动子；MCS：多克隆位点；

TT：转录终止序列；orieuk：真核复制起始序列。86二、重组DNA技术基本原理目的基因的获取DNA导入受体菌外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建重组体的筛选克隆基因的表达

分选接转筛表达87目的来源获取的方法蛋白表达cDNA(complementaryDNA)PCR内切酶基因序列、结构研究基因组DNA(genomicDNA)生物样本DNAmiRNA,siRNA化学合成分——目的基因的获取88基因组文库或cDNA文库基因片断（目的基因）新的表达载体或克隆载体重组DNA分子含重组分子的转化菌或真核细胞限制性内切酶双酶切受体菌或真核宿主细胞从基因组DNA文库获取目的基因89选——载体的选择与构建载体插入DNA片段宿主细胞质粒<5~10kb细菌，酵母λ噬菌体载体~20kb细菌黏粒~50kb细菌BAC~400kb细菌YAC~3Mb酵母多种克隆载体90接——目的DNA与载体连接粘末端连接单一相同黏端连接不同黏端连接通过其他措施产生黏端进行连接人工接头(linker)连接同聚物加尾连接平端连接粘-平末端连接91BamHⅠ切割反应

GGATCCCCTAGGT4

DNA连接酶15ºCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割载体DNA用BamHⅠ切割重组体载体自连目的基因自连同一限制酶切位点连接92不同限制酶切位点（非配伍末端）的连接EcoRⅠ切割位点Bg

lⅡ切割位点+EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切EcoRⅠ+Bg

lⅡ双酶切T4

DNA连接酶15ºC重组体配伍末端的连接情况和同一限制酶切位点连接相似。932.平端连接适用于：限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端目的基因载体限制性内切酶限制性内切酶T4DNA连接酶15ºC重组体载体自连目的基因自连94T-A克隆目的片段：由PCR获得。Taq聚合酶扩增产物在3’-端多加1-2个AT载体：3’-端突出1个T目的片段与载体：形成类似粘性末端的T-A配对95在末端转移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。

同聚物加尾连接5´3´3´5´载体DNA5´3´3´5´目的基因限制酶或机械剪切限制酶5´3´3´5´5´3´T(T)nT

T(T)nT3´5´5´

3´3´5´3´A(A)nA

A(A)nA3´5´λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端转移酶+dATP末端转移酶+dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nAT(T)nTT4

DNA连接酶15ºC重组体5´96由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。酶法PCR法

人工接头(linker)连接通过其他措施产生黏端进行连接EcoRⅠEcoRⅠ97受体菌条件安全宿主菌限制酶和重组酶缺陷处于感受态(competent)

导入方式转化(transformation)——细菌转染(transfection)——真核细胞感染(infection)——真核细胞（四）重组DNA导入受体菌98遗传物质传递常见的几个名词的区别类型受体细胞遗传物质（DNA）携带或交换方式结合细菌菌毛相连转化细菌外源DNA直接进入细胞转导细菌真核细胞由噬菌体携带遗传物质由病毒携带遗传物质转染真核细胞磷酸钙或脂质体包裹外源DNA99（五）重组体克隆的筛选和鉴定100（五）重组体的筛选

1.直接选择法(1)抗药性标记选择(2)标志补救(markerrescue)(3)分子杂交法原位杂交Southern印迹

2.免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等101一、载体表型选择法1、抗药性标记及其插入失活选择法原理：pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因:四环素Tetr和氨卞AmprTetr上有插入位点BamHI和SalI;Ampr上有插入位点PstI102pBR322103pBR322抗菌素标记选择四环素：

抑制细菌生长，但不杀死细菌氨苄青霉素抗性基因：产生-内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（蓝灰色）褪色环丝氨酸:杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌104选择过程：四环素抗性插入失活如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素加环丝氨酸平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死环丝氨酸作用机制是抑制细菌细胞壁粘肽的合成，从而使细胞壁缺损。105无环丝氨酸培养基106氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。107-半乳糖苷酶显色反应选择法原理：

载体上有一段-半乳糖苷酶基因（LacZ）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶（互补）。-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝++深蓝色108选择过程假阴性：如果插入的外源DNA正好是3的倍数并且没有中止密码；（不破坏肽）。109-半乳糖苷酶使Xgal分解成蓝色产物110根据插入基因的表型选择利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择。（只在特定条件下）原理：弥补缺陷转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷his-受体菌：外源基因：在不含组氨酸的培养基中生长his+111酶切电泳筛选法ABA或B112不同克隆的酶切结果113PCR扩增检测法原理PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。过程（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。（3）电泳PCR产物。（4）检查是否有PCR产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致114核酸杂交检测法原理：核酸杂交：重组克隆与探针杂交。识别标记放射性同位素：32P检测用的探针与外源DNA插入片断互补的序列。非放射性标记：荧光素115核酸杂交检测方法：

Southernblotting用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示酶切前酶切后插入片断载体116重组DNA技术操作过程可形象归纳为小结分分离目的基因选选择合适的载体接拼接重组体转转入受体菌筛筛选重组体