卢彦平-产前诊断相关技术及其临床应用简介

卢彦平-产前诊断相关技术及其临床应用简介第一页，共75页。遗传病的分类染色体病：

多基因病单基因病：孟德尔遗传病非典型遗传方式的单基因病

数目结构常规核型可见微缺失，微重复第二页，共75页。染色体病数目异常整倍体：四倍体：92XXXX，92XXXY…三倍体：69XXX，69XYY，69XXY非整倍体：单体型：45,X;45XX,-21三体型：21-三体,18-三体13-三体,47XXY(Klinefelter综合征)四体型：48,XXXX;48XXXY…..第三页，共75页。染色体病结构异常倒位（inv）：9号染色体臂间倒位缺失（del）：猫叫综合征（5p-重复（dup）易位（t）：有无遗传物质的丢失插入（ins）环形染色体（r）环形染色体（r）双着丝粒染色体：（dic）假双着丝粒染色体（psudic）第四页，共75页。染色体病的筛查与诊断环形染色体（r）

筛查血清学的筛查无创胎儿非整倍体检测

（NIPT)诊断取胎儿细胞进行核型分析绒毛取样取羊水取脐带血基因芯片（CMA）全基因组测序第五页，共75页。核型分析适用范围主要针对染色体数目异常、大的结构异常核型分析是产前诊断的基础。需要对胎儿细胞进行培养（包括绒毛、羊水、脐带血）,其是羊水细胞培养有一定的难度。优点：价格便宜，直观、可以检查染色体数目异常及大的结构异常（≥5Mb）无法判断染色体上微小片段的缺失及重复异常。第六页，共75页。CompanyLogo严重智力低下：100%，小头畸形50%枕骨扁平53-82%发际低80%颈部皮肤赘生皱褶80%无意识做鬼脸90%眼距宽，外眼角上斜80%伸舌各种先心病手短、宽通贯手（双手）小耳朵鼻根低平21三体第七页，共75页。CompanyLogo21-三体NT≥6mm鼻骨缺失/发育不全长骨短肾盂积水，单独不作为穿刺指征心脏缺陷肠道强回声：约7%21-三体患儿第八页，共75页。21三体：NT厚，心脏畸形301第九页，共75页。CompanyLogo新生婴儿中的发生率为1∶3500-8000，父、母亲高龄女孩比男孩发生率高，约为3-4∶1寿命平均70天

18三体综合征常为多发畸形18-三体第十页，共75页。CompanyLogo18三体-多发畸形颜面部：小下颌畸形、小眼、小嘴、小耳、耳位低颅脑畸形：草莓头45%，颅后窝池扩大、Dandy-walker畸形、小脑小、脉络丛囊肿肢体畸形：特殊握拳姿势、挠骨发育不良、挠骨缺如、拇指发育不良、并指等腹部畸形：小的脐膨出、膈疝肾脏：肾囊性发育不良、马蹄肾、肾积水心脏畸形：室缺，房室共道畸形、右室双出口其他：羊水过多，胎盘小，单脐动脉、脐带囊肿、脐静脉瘤、FGR第十一页，共75页。18-三体301301301第十二页，共75页。CompanyLogo13三体综合征（Pateau综合征）发生率1/5000多合并重要畸形颅脑畸形：小头畸形、前颅无裂畸形、Dandy-walker畸形、颜面部畸形：独眼、长鼻、正中唇裂、双侧唇裂肢体畸形：多指（趾）畸形心脏畸形：室缺、房室共道畸形、左心发育不良、心室内强回声腹部畸形：脐疝、肾积水、多囊肾其他：FGR、羊水过多、胎儿水肿、NT厚第十三页，共75页。CompanyLogo

13-三体30岁23周B超发现畸形：

前脑无裂、正中唇裂、心脏畸形（右心大、左心小）、单脐动脉、脐疝、多趾畸形核型分析13-三体

301第十四页，共75页。性染色体异常Turner综合征：45，X

1/2500，女婴特征：FGR颈部水囊瘤原发性闭经、不孕，短颈、颈蹼、发迹低、身材矮小、肘外翻，15-50%合并心血管畸形第十五页，共75页。性染色体异常克氏征（klinefeltersyndrome):47,XXY

男性新生儿发病率为1/600-800，与母亲高龄有关

表现：出生时表现正常，隐睾发生率高，身高较高，青春期中期出现睾丸功能紊乱，高促性腺激素性性腺功能低下，睾酮减少，除极个别情况外基本不育。第十六页，共75页。超雌（47，XXX；48，XXXX；49，XXXXX）

发病率1/1000女婴，与母亲高龄相关。

特征：外表正常，身材较高，智商较同胞稍低，语言能力差，社会适应能力差超Y:47，XYY，48，XYYY，49，XYYYY1/1000男婴

特征：出生时无异常，从2岁开始发育速度加快，身高比正常人高，智商略低于同胞，但在正常范围。部分脾气暴躁，有对抗性行为，犯罪主要与低智商有关。可生育正常后代。

性染色体异常第十七页，共75页。微缺失重复的检测BoBs基因芯片全基因组测序第十八页，共75页。Wolf-Hirschhorn综合征-4p16.3缺失具有特殊面容：头小而长．前额突出。中线头皮缺陷。眼距宽．内眦赘皮，鹫形鼻，高眉弓直通眉心，人中深、短．下颌小而后缩。耳大且低，结构简单掌纹复杂，脚趾不规则生长发育障碍、智力低下、肌张力减退、癫痫、先心病、骨骼畸形等各种异常第十九页，共75页。Williams-beuren(7q11.23)spanning1.5millionto1.8millionbasepairsandcontaining26to28genes.临床表型包括心血管疾病、特殊面容、神经行为异常和一过性婴儿期高钙血症特征性面容：张嘴凸唇，鼻梁扁平，鼻孔朝天，长人中，小下颌，星状虹膜和斜视，牙齿缺失，牙釉质缺陷，牙齿稀疏，咬合不正。非凡的音乐才能第二十页，共75页。Langer-Giedion（）（毛发-鼻-指（趾）综合征）第二十一页，共75页。Prader-Willi综合征隐睾-侏儒-肥胖-智力低下综合征

①大部分(70％)有15q11．q13父源缺失②母源单亲二倍体（UPD）约占25％③少数(<5％)存在甲基化过程异常或单一致病的印记基因突变特征：临床以多食、肥胖、身材矮小、发育迟缓、出生后低张力、性腺功能低下以及生长激素缺乏为特征糖尿病面容：颌小畸形，耳畸形，牙齿缺损，齿列异常第二十二页，共75页。第二十三页，共75页。Angelman综合征快乐木偶综合征，天使综合征母源15q11.2-13缺失(约70％)父源单亲二倍体第二十四页，共75页。Miller-Dieker综合征（17p13.3）无脑回、巨脑回胼胝体缺如面部异常小头、前额高低不平小鼻，伴鼻孔前倾，上唇有细小的朱红边线，耳位低，或后移隐睾、藏毛窦、第5指弯曲第二十五页，共75页。Smith-Magenis综合征染色体17p11．2微缺失或RAI基因杂合性突变自我伤害行为、痛阈低下；褪黑素分泌异常、昼夜睡眠颠倒、生物钟紊乱；喜将外物插入身体有孔部位，易怒。第二十六页，共75页。AgeprogressionoffemalesubjectswithSMS.TypicalSMSinfantphenotypewith'tented'upperlipanddepressednasalbridgeatbirth(a),atage4months(b),andwithhand-claspingbehavioratage1year(c)isshown.Awhitepatchonthedorsumofleftforearmduetoskinpickingisillustratedinatoddler(alsohandclasping)atage2years(d).Thesameindividualatages13years(e)and20years(f),andphotosat21yearsofageillustratingopenwoundsandscarringonforearmsfromskinpicking(g),brachydactylyandnail-yankinglesionsonhands(h),andfeetwithbrachydactylyandnailsdamagedfromnailyanking第二十七页，共75页。Digeorge综合征22q11.2缺失特殊面孔，如眼眶距离增宽，耳廓位置低且有切迹，上唇正中纵沟短颌小和鼻裂。常存在大血管异常，如法洛四联症和主动脉弓右位第二十八页，共75页。染色体微阵列技术(CMA)

CMA在全基因组水平进行扫描

可检测染色体不平衡的拷贝数变异(copynumbervariant，CNV)，尤其是对于检测染色体组微小缺失、重复等不平衡性重排等具有突出优势。可检测从几十到上千kb的基因组缺失或重复。其检测水平由所用探针序列大小及两种探针序列间的距离决定

基于比较基因组杂交的微阵列(array-CGH)

基于单核苷酸多态性的微阵列(SNParray)。

可以检出单亲二倍体和三倍体第二十九页，共75页。产科、产前诊断领域的应用范围．

对自然流产、胎死宫内、新生儿死亡等妊娠产物的遗传学检测。对产前诊断中核型分析结果异常，但无法确认异常片段的来源和性质者进行DNA水平的更精细分析。

对产前超声检查异常而染色体核型分析结果正常的胎儿进一步行遗传学检测。第三十页，共75页。局限性无法可靠地检出低水平的嵌合体无法检出平衡性染色体重排和大多数的基因内点突变aCGH检测平台无法检出三倍体CMA的阳性检出率仍然较低，对于超声检查发现结构异常但胎儿染色体核型正常的病例，目前CMA增加检出致病性CNV的比例<10％临床意义不明的CNV的判读和解释存在困难。对胎儿父母样本进行检测、综合家系分析对VOUS结果的判读和解释有一定帮助

产前CMA检测前和检测后，进行恰当的遗传咨询十分重要第三十一页，共75页。SNP-array1号染色体2号染色体3号染色体第三十二页，共75页。SNP-array21-三体第三十三页，共75页。CompanyLogo34

7号染色体长臂存在缺失0.18Mb，15号染色体长臂存在重复2.03Mb，X染色体整体发生缺失病例：颈部淋巴囊肿伴全身水肿，胸腔积液，胎死宫内，染色体核型分析失败第三十四页，共75页。病例：超声提示平滑脑，双侧腭裂，NT厚，双眼球小，左肾缺如，单脐动脉胎儿全基因组测序，4号染色体部分缺失，13号部分重复第三十五页，共75页。单亲来源第三十六页，共75页。流产组织-69XXY第三十七页，共75页。显示1p36．33(a)和1q21．3-q22(b)区域均存在重复第三十八页，共75页。目前可以参考国际公共病理性CNVs数据库[theDatabaseofChromosomalImbalanceandPhenotypeinHumansusingEnsemblResources(DECIPHER，http：／／www．sanger．ac．uk／PostGenomics／decipher)]与国际公共良性CNVs数据库[theDatabaseofGenomicVariants(http：／／www．projeets．tcag．ca／variation／)

第三十九页，共75页。NIPT1997年发现孕妇血浆中存在游离DNA2008年发明通过生物计算的方法筛查21三体2012年中国专家共识第四十页，共75页。

开展了无创检测胎儿非整倍体的研究共检测5300余例发现染色体异常39例，其中包括21三体34例（其中28例行羊穿），18三体6例（其中5例行羊穿），均符合缓解了羊水穿刺的压力，提高了穿刺的阳性率羊水穿刺21三体阳性率约为3.03%，21三体和18三体的总阳性率约为3.83%NIPT第四十一页，共75页。单基因病目前认为人类约有2万5千个基因第四十二页，共75页。单基因病的诊断第一代测序技术及其应用

l977年，第一代测序技术问世（Sanger测序法)

基因测序技术的出现极大地推动了分子生物学的发展。利用该技术，投入几十亿美元，耗时13年，完成了人类遗传密码30亿对碱基序列的测定

第四十三页，共75页。单基因病分类常染色体显性遗传：软骨发育不全常染色体隐性遗传：PKU，脊髓性肌萎缩症SMAX-连锁显性遗传：2型色素失调症X-连锁隐性遗传：假肥大性肌营养不良DMDY-连锁遗传？第四十四页，共75页。单基因病的非典型遗传方式基因组印迹：某些遗传病的出现或严重程度取决于这些基因是来自父方还是母方，这种不同亲本来源的某些染色体特异位置上的同源基因在子代中差异表达的现象叫基因组印迹15q11-q13缺失Prader-Willi综合征---父源缺失Angelman综合征-----母源缺失第四十五页，共75页。单基因病的非典型遗传方式单亲二体型：一个个体的两条同源染色体来源于同一亲本，缺乏另一亲本来源的同源染色体，这种个体称为单亲二体。Prader-Willi综合征----母源单亲二体Angelman综合征-----父源单亲二体巨舌-脐膨出综合征（BWS）第四十六页，共75页。单基因病的非典型遗传方式嵌合体：三核苷酸重复—脆X综合征，男性发病率1/1200，FMR-1CpG岛内CGG重复序列有关，正常人低于50次，患者超过200次

亨廷顿病；脊髓小脑性共济失调；强直性肌萎缩线粒体遗传：16569个碱基对，37个基因

母系遗传，异常线粒体超过阈值致病第四十七页，共75页。Sanger测序法基本方法为对某个基因的外显子及其相邻的内含子区域设计引物，以测序引物进行延伸反应，并由带有四色荧光标记产物通过毛细管电泳进行分离和检测单次可获得800bp以上的序列。该传统的基因测序技术为基因测序工作带来了极大的便利。目前确认基因突变的金标准。第四十八页，共75页。致病基因的筛选根据表型确定致病基因

候选基因设计引物PCR

测序连锁分析—依靠家系分析第四十九页，共75页。Sanger测序法限制一代测序的高成本和低通量的缺陷限制了其在大规模测序中的应用。我们进行胎儿短肢畸形的研究，涉及的基因很多FGFR3、COL1A1、COL1A2、TRIP11、SLC26、SOX9等多个基因，在诊断不明的情况下需要对涉及的候选基因一一检测，有些基因很大，要设计数十对甚至上百对引物才能检测完成，费时费力费钱。

卢彦平,程静,汪龙霞,汪淑娟,熊莉华,高志英,袁慧军,李亚里,胎儿短肢畸形的基因突变位点筛查。中华围产医学杂志，2012年8期

第五十页，共75页。新一代测序技术技术特点边合成边测序高通量、低成本、海量的数据。生物学信息分析成为分子生物学领域的重要内容产前诊断中的应用：

染色体病：NIPT

，微缺失重复

单基因病：致病基因筛查

第五十一页，共75页。外显子组测序

外显子组测序：全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序外显子区域包含着合成蛋白质所需要的信息，涵盖了与个体表型相关的大部分功能性变异单基因病，不必再依赖于完整的家系。自于不同家系的样本一起研究，耗时明显缩短海量的数据分析是一难题。第五十二页，共75页。目标区域测序目标区域捕获测序是利用针对感兴趣的基因组区域定制的探针与基因组DNA进行芯片杂交或溶液杂交，将目标基因区域DNA富集后再利用高通量测序技术进行测序的研究策略。目标区域测序大幅缩小了测序区域，在保证获得足量目标基因变异信息的前提下，极大地降低了样品的测序成本可订制目标外显子捕获panel，用于特定的研究。第五十三页，共75页。目标外显子测序的临床应用---我们的工作骨骼畸形目标外显子捕获初级纤毛相关疾病目标外显子捕获第五十四页，共75页。例1：孕18周，双顶径4.0cm，股骨长1.1cm，颅骨骨化差，胸腔狭窄，腹部膨隆，四肢短小，肱骨粗短

进行了FGFR3全外显子及SLC26A2，Trip11基因检测未发现致病基因突变第五十五页，共75页。突变基因转录本编号外显子编号核苷酸变化氨基酸变化突变位置测序深度Hom/Het遗传类型COL1A1NM_000088exon45c.3307G>Ap.G1103Schr17-4826529914/14(0.50)hetAD二代测序结果301医院第五十六页，共75页。例2:孕23+5，双顶径5.6，股骨长2.7cm,股骨弯曲，四肢短小301医院第五十七页，共75页。例5：30+3，胎儿股骨偏短，羊水过多，双顶径8.2，股骨长5.1EVC基因在复合杂合第五十八页，共75页。初级纤毛相关遗传病分布在脊椎动物的多数细胞表面9+0结构，细胞天线感受到多种类型的信号，如光、机械能、渗透压、温度及激素等结构和功能改变可引起多种疾病第五十九页，共75页。罕见的一类遗传病涉及人体多种器官，如肾脏、脑部、四肢、眼部、耳、肝脏、骨骼等。包括多囊肾、肝胆疾病、多指/趾、胼胝体缺失、认知障碍、视网膜退化、后颅窝缺陷、骨骼异常、肥胖等初级纤毛相关遗传病第六十页，共75页。

初级纤毛相关遗传病第六十一页，共75页。Mechel综合征胎儿大体所见

显示枕骨缺损脑组织膨出，颈背部水肿第六十二页，共75页。

Meckel综合征胎儿大体解剖III-3

III-4MKS3基因突变第六十三页，共75页。Meckel综合征--TCTN2基因突变

301医院第六十四页，共75页。Joubert综合征临床症状包括肌张力减退、共济失调、精神发育迟缓及动眼运动障碍、新生儿呼吸异常等。脑部核磁标志性特征为“磨牙征”(小脑吲部发育不全或缺失，小脑上脚增宽，后颅窝加深的征象)。Joubert综合征相关病症Joubert并不同程度的累及其它器官，主要是肾和眼，尚有多指、肝脏纤维化等。第六十五页，共75页。Joubert综合征(JBTS)case：第一孩儿童医院诊断Joubert综合征二代测序找到突变（CEP290)再次怀孕超声提示胎儿小脑蚓部缺失引产同时基因检测证实与先证者携带相同的基因突变第六十六页，共75页。多囊肾婴儿型多囊肾：PKHD1多囊肾可以是其它初级纤毛疾病的表型之一

case：

孕期胎儿双侧多囊肾，羊水少，怀疑婴儿型多囊肾，引产基因检测没有发现PKHD1突变，结果发现AHI1基因突变，此基因可以引起Joubert综合征及Meckel综合征提示发现多囊肾时要仔细检查其他部位，尤其是脑部第六十七页，共75页。全外显子组测序

先天性关节挛缩病例

两个异常孩子死亡，没有留下DNA？1500个基因，没有发现异常

全外显子组？第六十八页，共75页。

/pubmed/?term=Harris%20DJ[Author]&cauthor=true&cauthor_uid=23261301AmJMedGenetA.2015Apr;167A(4):731-43.doi:10.1002/ajmg.a.37018.Epub2015Feb23.

ECEL1mutationcausesfetalarthrogryposismultiplexcongenita.

早孕晚期超声已经诊断

全外子组测序发现ECEL1基因突变.Arthrogryposismultiplexcongenita(AMC)isadescriptorfortheclinicalfindingofcongenitalfixationofmultiplejoints.WepresentaconsanguineoushealthycouplewithtwopregnanciesdescribedwithAMCduetocharacteristicfindingsonultrasonographyoffixatedkneeextensionandreducedfetalmovementatthegestationalageof13weeks+2daysand12weeks+4days.Bothpregnancieswereterminatedandpostmortemexaminationswereperformed.ThepostmortemexaminationsconfirmedAMCandsuggestedadiagnosisofcentronuclearmyopathy(CNM)duetocharacteristichistologicalfindingsinmusclebiopsies.Wholeexomesequencing(WES)wasperformedonallfourindividualsandtheoutcomewasfilteredbyapplicationofmultiplefiltrationparameterssatisfyingarecessiveinheritancepattern.Onlyonegene,ECEL1,waspredicteddamagingandhadpreviouslybeenassociatedwithneuromusculardiseaseorAMC.ThevariantfoundECEL1isamissensemutationinahighlyconservedresidueandwaspredictedpathogenicbypredictionsoftware.第六十九页，共75页。ExpandingthephenotypicspectrumofECEL1-relatedcongenitalcontracturesyndromes.ShaabanS1,DuzcanF,YildirimC,ChanWM,AndrewsC,AkarsuNA,EngleEC.Usingacombinationofhomozygositymappingandwhole-exomesequencing(WES),weidentifiedanovelmissensec.1819G>Amutation(G607S)intheendothelin-convertingenzyme-like1(ECEL1)geneinaconsanguineouspedigreeofTurkishoriginpresentingwithasyndromeofcamptodactyly,scoliosis,limitedkneeflexion,significantrefractiveerrorsandophthalmoplegia.ECEL1mutationswererecentlyreportedtocauserecessiveformsofdistalarthrogryposis.ThisreportexpandsonthemolecularbasisandthephenotypicspectrumofECEL1-associatedcongenitalcontracturesyndromes.第七十页，共75页。AbstractSendto:

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AmJHumGenet.2013Jan10;92(1):150-6.doi:10.1016/j.ajhg.2012.11.014.Epub2012Dec20.MutationsinECEL1causedistalarthrogryposistype5D.McMillinMJ1,BelowJE,ShivelyKM,BeckAE,GildersleeveHI,PinnerJ,GogolaGR,HechtJT,GrangeDK,HarrisDJ,EarlDL,JagadeeshS,MehtaSG,RobertsonSP,SwansonJM,FaustmanEM,MeffordHC,ShendureJ,NickersonDA,BamshadMJ;UniversityofWashingtonCenterforMendelianGenomicsAbstractSendto:

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AmJHumGenet.2013Jan10;92(1):150-6.doi:10.1016/j.ajhg.2012.11.014.Epub2012Dec20.MutationsinECEL1causedistalarthrogryposistype5D.McMillinMJ1,BelowJE,ShivelyKM,BeckAE,GildersleeveHI,PinnerJ,GogolaGR,HechtJT,GrangeDK,HarrisDJ,EarlDL,JagadeeshS,MehtaSG,RobertsonSP,SwansonJM,FaustmanEM,MeffordHC,ShendureJ,NickersonDA,BamshadMJ;UniversityofWashingtonCenterforMendelianGenomicsAbstractSendto:

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AmJHumGenet.2013Jan10;92(1):150-6.doi:10.1016/j.ajhg.2012.11.014.Epub2012Dec20.MutationsinECEL1causedistalarthrogryposistype5D.McMillinMJ1,BelowJE,ShivelyKM,BeckAE,GildersleeveHI,PinnerJ,GogolaGR,HechtJT,GrangeDK,HarrisDJ,EarlDL,JagadeeshS,MehtaSG,RobertsonSP,SwansonJM,FaustmanEM,MeffordHC,ShendureJ,NickersonDA,BamshadMJ;UniversityofWashingtonCenterforMendelianGenomicsAmJHumGenet.2013Jan10;92(1):150-6.MutationsinECEL1causedistalarthrogryposistype5D.Distalarthrogryposis(DA)syndromesarethemostcommonoftheheritablecongenital-contract