生物技术前沿进展之二RTPCR

TaqManREAL-TIMEPCR第一页，共六十九页。什么是RealTimePCR?实时监控特定核酸目标序列PCR扩增的技术Technologytomonitor,inreal-time,thePCRamplificationofspecificnucleicacidtargets第二页，共六十九页。RealTimePCR是如何实现的?在PCR混合液中含有荧光物质（fluorescence）第三页，共六十九页。RealTimePCR是如何实现的? 随着扩增的进行,荧光信号会随着PCR产物的增加而增加PCRPCRLotsofPCRPCRproduct第四页，共六十九页。RealTimePCR是如何实现的?Real-timePCR仪会纪录每个循环的荧光信号变化Cycle3FilterASample1BinN第五页，共六十九页。RealTimePCR是如何实现的?最后，RealTime软件会对采集到的数据进行分析第六页，共六十九页。RealTimePCR化学原理荧光信号是怎样随着PCR产物的增加而增加的呢？SYBR®GreenITaqMan®第七页，共六十九页。TaqMan®化学原理

(又称5’-Nuclease)第八页，共六十九页。TaqMan®

化学原理TaqMan®中会使用到两段短片段序列，称为双向特异引物第九页，共六十九页。TaqMan®

化学原理TaqMan®中第三段短片段序列称为探针，结合到序列中间第十页，共六十九页。TaqMan®

化学原理探针标记两种染料分子报告染料Reporterdye淬灭染料Quencherdye第十一页，共六十九页。TaqMan®

化学原理完整的探针报告染料Reporterdye淬灭染料Quencherdye第十二页，共六十九页。TaqMan®

化学原理完整的探针光(激发)能量报告染料Reporter没有荧光信号第十三页，共六十九页。TaqMan®

化学原理如果探针断裂了……光(激发)第十四页，共六十九页。TaqMan®放映开始

第十五页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Denaturatingoftemplate（模板变性）第十六页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Annealingofoligos（引物退火）第十七页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶登场……第十八页，共六十九页。TaqMan®

化学原理找到引物序列……第十九页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Extensionofprimers（序列延伸）第二十页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Extensionofprimers（序列延伸）第二十一页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Extensionofprimers（序列延伸）第二十二页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Extensionofprimers（序列延伸）第二十三页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Extensionofprimers（序列延伸）第二十四页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Extensionofprimers（序列延伸）?第二十五页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶很特别……具有核酸外切酶活性，可以“吃掉”结合到模板上的DNA片段第二十六页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶开始降解探针第二十七页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶开始降解探针第二十八页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶开始降解探针第二十九页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶开始降解探针第三十页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶开始降解探针第三十一页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶开始降解探针第三十二页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶开始降解探针第三十三页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶开始降解探针第三十四页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶开始降解探针第三十五页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶开始降解探针第三十六页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶开始降解探针第三十七页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶开始降解探针第三十八页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶开始降解探针第三十九页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶开始降解探针第四十页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶开始降解探针第四十一页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶开始降解探针第四十二页，共六十九页。TaqMan®

化学原理Taq酶开始降解探针嗝!第四十三页，共六十九页。TaqMan®

化学原理新的序列，新的信号！第四十四页，共六十九页。SYBR®GreenI化学原理第四十五页，共六十九页。SYBR®GreenI化学原理第四十六页，共六十九页。SYBR®GreenI化学原理第四十七页，共六十九页。SYBR®GreenI化学原理新的序列，新的信号！第四十八页，共六十九页。SYBR®GreenI化学原理非特异结合任意双链DNA定量结果不准确可能产生非特异性PCR产物信号第四十九页，共六十九页。SYBR®GreenI化学原理使用Meltcurve(DissociationCurve)检查PCR反应产物的特异性TemperatureFluorescence原始图谱第五十页，共六十九页。SYBR®GreenI化学原理使用Meltcurve(DissociationCurve)检查PCR反应产物的特异性TemperatureFluorescence导数图谱第五十一页，共六十九页。RealTimePCR化学原理每个循环之后理论上，反应管里的目标片断数会加倍。荧光信号相应成比例增长。第五十二页，共六十九页。RealTimePCR化学原理TaqMan®,还是...SYBR®GreenI?优点更高的特异性不会有引物二聚体干扰支持多重荧光实验设计实验方法易于优化缺点

价格稍贵优点价格便宜大部分基因以及少量样品均适用缺点特异性稍差必须要做Meltcurves

不支持多重荧光设计实验方法通常需要优化第五十三页，共六十九页。RealTimePCR实际状态线形图谱Linear

半对数图谱Log第五十四页，共六十九页。RealTimePCR常用术语Baseline基线定义背景区域:cycle-to-cycle

的范围第五十五页，共六十九页。Baseline基线的设置通常基线起点为Cycle3…第五十六页，共六十九页。Baseline基线的设置通常基线终点设置在实验信号脱离噪音信号上升前第五十七页，共六十九页。Baseline基线的设置软件自动设置基线软件自动为您选定基线区域第五十八页，共六十九页。Baseline基线的设置软件自动设置基线每个样品单独设置基线。可以使每个样品拥有“完美”基线。可以照顾到既有高浓度样品也有低浓度样品的实验。第五十九页，共六十九页。RealTimePCR常用术语Threshold阈值在扩增曲线上，可以调节的一条水平线告诉软件到哪里获得分析数据

Threshold第六十页，共六十九页。Threshold阈值的设置最佳位置:Xn=X0·2n成立（指数/对数扩增期）第六十一页，共六十九页。Threshold阈值的设置软件自动设定阈值第六十二页，共六十九页。Threshold阈值的设置软件自动设定阈值对于不同的批次的实验，需要单独设置阈值因为不同批次的实验，会有不同的指数/对数扩增期第六十三页，共六十九页。RealTimePCR常用术语Cyclethreshold（又称Ct值）扩增曲线与阈值的焦点，对应的带小数点的循环数Thiscurvecrossesthethresholdatcycle23.1第六十四页，共六十九页。Ct值的获得自动分析手动分析基线决定阈值阈值决定Ct值第六十五页，共六十九页。Ct值的获得基线决定阈值Linear图里找基线，基线对应曲线形状第六十六页，共六十九页。Ct值的获得阈值决定Ct值Log图里找阈值，指数期对应阈值第六十七页，共六十九页。AB支持3种技术应用Presence/Absence++-+AllelicDiscriminationEnd-point终点检测QuantitativePCRReal-time实时检测第六十八页，共六十九页。内容总结TaqManREAL-TIMEPCR。LotsofPCR。SYBR®GreenI。TaqMan®化学原理

(又