荧光定量PCR实验设计及优化-lxm

荧光定量PCR实验设计及优化-lxm第一页，共32页。PCR的建立与优化核酸纯化与逆转录PCR试剂体系引物、探针的设计2第二页，共32页。3长度 16-24bases（引物）序列 不能有以下情况：任意2个引物或探针之间的序列互补引物或探针本身有二级结构连续的>GGG，引物的5’端有G引物3’端最后5个碱基有2个以上的G或C引物3’端最后1个碱基为AGC含量

40-60%GC

GC/AT分布大致均衡,C含量>G探针复性温度

65－70°C引物复性温度60－65°CPCR引物与探针3第三页，共32页。标记

淬灭基团采用无荧光背景的如BHQ,不要用tamraPCR产物长度 50－150bpDesign primerdesignsoftware，选择序列保守区域如果保守区域太短，可以在引物中考虑引入LNA提高Tm

探针可以考虑引入LNA或改用MGB或自淬灭taqman探针简并引物或探针需要同时考虑多种情况下的Tm高低纯化与否

PAGE/HPLC

PCR引物与探针4第四页，共32页。SNP的Taqman双色检测中，突变探针一般Fam标记相对定量分析中内参基因一般Hex标记(例如Roche的UPL相对定量解决方案)

对检测要求更高的建议Fam标记(灵敏度或者定量vs定性)

扩增效率较差的建议Fam标记

PCR引物与探针5第五页，共32页。ReactionConditions

PrimersandProbesConcentrationRange(finalcon.)Primers: 0.1µM–1.0µMeachProbes: 0.1µM–0.5µMStandardConcentrations(finalconc.)Primers: 0.5µMeachProbes: 0.2µMExample:UniversalProbeLibraryassayHigherprimers/probeconcentrationsgivebettersignaltonoiseratio(higherfluorescencesignalintensitiy)OnlyminorinfluenceonCpwhenusedinmediumconcentrationranges6第六页，共32页。PCR的建立与优化核酸纯化与逆转录PCR试剂体系引物、探针的设计7第七页，共32页。建立新的PCR体系:

GeneralHints模板 -DNA或

cDNA为模板对照-NTC(notemplatecontrol)每个探针引物组合

-阳性对照

(如果可能)分析

-扩增:sensitivityandefficiencyofPCR(crossingpoints)-熔解曲线分析

(SYBRGreenIformat):检测引物二聚体或其它非特异性扩增凝胶电泳:验证非特异性扩增meltingcurve(杂交探针等模式):突变检测或亚型分析8第八页，共32页。StandardConditionsinPCRMgCl2Concentration:2-5mM9第九页，共32页。BasicOptimizationinPCRUseanytemplatenucleicacid(NA)suitableforPCR,sufficientlypurifiedandfreeofPCRinhibitorsTemplateConcentration: 建议测试多个稀释度

(最少2个梯度,10^2)genomicDNA 50ng-5pgplasmidDNA approx.106copies

RNA ≤500ngtotalRNAor100ngmRNAcDNA ≤50ngequivalentoftotalRNA，RTproductundiluted,1:10and1:100dilutionsNAStorageStorenucleicacidsinhighconcentrationsandaliquotsForlowtemplateconcentrations,usesiliconizedtubesandadd

carrierNA(10ng/µl),e.g.MS2RNA10第十页，共32页。BasicOptimization:

MgCl2TitrationMgCl2Titration:2-5mMFormat:SYBRGreenILCFastStartDNAMaster11第十一页，共32页。BasicOptimization:

TemplateConcentration

模板浓度过高会抑制PCR

TemplateDNA

undilutedand1:10dilutionFormatSYBRGreenILIghtCycler®DNAMasterNTCsample1originalsample11:10sample2originalsample21:1012第十二页，共32页。SYBRGreenIFormat

PCRAnalysisExample

模板拷贝数越低，越容易出现引物二聚体QuantificationMeltingCurveAnalysis13第十三页，共32页。Optimization:

InfluenceofPCRInhibitors

PCR抑制物可通过适当稀释样品降低对其对PCR的影响NTCcDNAoriginalcDNA1:2cDNA1:4cDNA1:20TemplatecDNA

undiluted,1:2,1:4,1:20dilutionsFormatSYBRGreenILightCycler®DNAMaster14第十四页，共32页。FurtherOptimizationinPCR检测灵敏度和信号强度可以通过调整下列参数得以改进15第十五页，共32页。PCR的建立与优化核酸纯化与逆转录PCR试剂体系引物、探针的设计16第十六页，共32页。AAAAAAAAAAAAtRNAmRNArRNARNase不同丰度组织名称样品量总RNA含量高丰度肝脏1mg2-4μg脾脏1mg心脏1mg中丰度大脑1mg0.05-2μg胚胎1mg肾脏1mg肺1mg低丰度膀胱1mg0-0.05μg骨1mg脂肪1mg高丰度成纤细胞1050.5-1μg人白细胞105细胞中RNA的种类和含量第十七页，共32页。“chaotropicsalts”inbindingbufferRoche手工提取RNA的试剂盒细胞和组织HighPureRNAIsolationKitHighPureRNATissueKitTriPureIsolationReagent甲醛固定石蜡包埋组织和石蜡包埋组织HighPureFFPERNAMicroKitHighPureRNAParaffinKit提取mRNAmRNAIsolationKitmRNACaptureKitHighPuremiRNAIsolationKit病毒RNAHighPureViralRNAKit*HighPureViralNucleicAcidKit第十八页，共32页。RNA操作注意事项RNA酶（Rnase）是导致RNA降解最主要的物质。此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的Rnase完全失活。1.Rnase广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须戴手套2.

Rnase可存在于取液器中，因此设置RNA专用pipettor,或者采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。3.塑料制品、玻璃和金属物品的处理

a.尽量已标明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不必处理，

处理步骤：在浸泡塑料制品的容器中，加入终浓度为0.05%~0.1%的DEPC-H2O，室温放置过夜，第二天将DEPC-H2O倒出，高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。b.玻璃和金属物品250℃烘烤3小时以上或者180℃烘烤8小时以上第十九页，共32页。RNA操作注意事项

选择新鲜血液，不得超过4小时

选择新鲜、生长旺盛的组织

选择处于生长旺盛时期的细胞可将新鲜血液先进行红细胞裂解，得到白细胞，然后加入一定量的细胞裂解液/TRNzol，-70℃保存较长时间

推荐使用专门的RNA样品储存液进行储存

去掉培养基，加入一定量RNA提取试剂，-70℃保存较长时间RNA应分装后冻存于-70冰箱，样品不能反复冻融长期保持：RNA提取步骤进行到在70%乙醇洗涤时，停止实验，让RNA保存于70%乙醇中第二十页，共32页。RNA的评价与鉴定纯度（OD260/OD280

）：OD260/OD280<1.9说明有蛋白污染OD260/OD280＝1.9～2.1说明纯度很好OD260/OD280>2.1说明有部分降解得率（OD260）Yield＝OD260×稀释倍数×40ng/ul紫外分光光度计检测第二十一页，共32页。1％琼脂糖，6V/cm，15min，上样1～3ul

电泳检测M12M12DNA残留蛋白残留RNA的评价与鉴定第二十二页，共32页。RT反应主要组成成分ReverseTranscriptase

AMVReverseTranscriptase(AvianMyeloblastosisVirus)48–55°C

M-MuLVReverseTranscriptase(MoloneyMurineLeukaemia)37–42°CTranscriptorReverseTranscriptase(recombinant,E.coli.)upto65°C引物（OligodTorRandomPrimersorGeneSpecificPrimers)Sequence-specificprimersRandomHexamerPrimersandanchoredoligo(dT)NRNA模板23第二十三页，共32页。TranscriptorReverseTranscriptaseTranscriptorreversetranscriptaseAbilitytosynthesizefragmentsupto14kb(fulllengthcDNA)Reversetranscriptionofdifficulttemplates(e.g.,GC-richRNAtemplates)duetothermostabilityupto65°CRNaseHactivity:degradesRNAinRNA:DNAhybridTranscriptorRTInvitrogenSuperscriptIIInvitrogenSuperscriptIIIMaxProductsize14kb12.3kb12.3kbReactiontime30mins50mins30-60minReactiontemperature42-65℃42℃50-55℃Sensitivity50pgtotalRNA1ngtotalRNA10pgRNAGC-richtemplateYESNoinfoNoinfoRNaseHactivityYESReducedReduced24第二十四页，共32页。一步法RT-PCR

VS.二步法RT-PCR2-stepRT-PCRreversetranscriptionandPCR-amplificationseparately1-stepRT-PCRreversetranscriptionandPCR-amplificationinonereaction

everythingforreversetranscriptioneverythingforPCR108copiesofthesequenceofinteresteverythingforreversetranscriptionNewlysynthesizedcDNAcDNAtogetherwitheverythingforPCR108copiesofthesequenceofinterest25第二十五页，共32页。一步法和二步法RT-PCR优点比较一步法RT-PCR的优点二步法RT-PCR的优点降低污染的风险SingletubeReactionNotransfer/openingrequiredAutomationispossible可以分别优化RT和PCR反应条件Efficientandaccurateamplification增加了灵敏度和特异性Sequence-specificprimersEntirecDNAsampleaspCRtemplate更加灵活AllowschoiceofprimerscDNAfromasingleRTcanbeusedinseveralPCRsWidechoiceofRTandPCRenzymes减少反应时间FewerpipettingstepsReducedtotaltimeofRT-PCR可以最大扩增到14kbAmplifyRNAsequencesupto14kb26第二十六页，共32页。TranscriptorHiFicDNASynthesisKitFeaturesBlendofTranscriptorenzymeandaproofreadingproteinAchieve7-foldhigherfidelitycomparedtonormalreversetranscriptasesObtainfull-lengthcDNAsynthesisinonly10minDetectaslowas10pgtemplateRNAApplicationsSequencingtranscriptomesQuantitativeRT-PCRapplicationsRNAsplicinganalysisCloninggenesofinterestGeneratingcDNAlibrarieswithlargeandfull-lengthinserts27第二十七页，共32页。ProductComparison

TranscriptorReverseTranscriptaseTranscriptorUniversalcDNAMasterTranscriptor1stStrandSynthesisKitTranscriptorHighFidelitycDNASynth.KitSuperScriptIII1stStrandSynthesisSystemSensitivity50pgRNA0.1pgRNA1ugRNA10pgRNA1pgRNAMaxfrag.length14kb1kb14kb14kb12kbReactionTime30min10min30min10min50minRTTemp.60oC60oC60oC60oC50oCFidelity+/-+/-+/-++n/aMastermixnoyesnononoUsedforqPCR,RTqPCRqPC