实验一水质的微生物检测

水微生物检测南华大学预防医学与放射卫生实验教学中心教学对象：高等医学院校卫生检验专业学生实验课时：8学时课程类型：专业实验课课程要求：必修每组人数：2人实验目的与要求掌握水样采集规则及注意事项。熟悉常用水卫生细菌学指标。熟悉菌落总数、大肠菌群的测定方法及检测意义。学会对所检测的水样作综合分析。水微生物检测的意义水体的微生物污染问题日趋严重。在各种水体，特别是污染水体中存在有大量的有机物质，适于各种微生物的生长。水体中微生物污染的来源：土壤，以及人类、动物的排泄物污染。水体中少数致病微生物（主要来自人或动物的粪便污染）可导致某些肠道传染病传播。水微生物检测可用于评价水质情况，预报水质的污染趋势，以保证水质的卫生安全。在实际工作中，对水质卫生质量的评价和控制，是无法对水体中各种可能存在的致病微生物一一进行检测。一般选择有代表性的一种或一类微生物作为指示菌，通过对指示菌的检测，来了解水体是否受到过的微生物污染，是否有肠道病原微生物存在的可能。水微生物的检测指标菌落总数(aerobicbacterialcount)是指1ml水样在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养后，所生长的细菌菌落的总数。检测意义：作为一般性污染的指标，即评价被检样品的微生物污染程度和安全性。水样菌落总数越多，说明水被微生物污染程度越严重，病原微生物存在的可能性越大，但不能说明污染的来源。水质微生物的检测指标总大肠菌群(coliformbacteria)是指一群需氧及兼性厌氧的，37℃生长时能使乳糖发酵，在24h内产酸产气的革兰氏阴性无芽胞杆菌。检测意义：作为粪便污染的指标。水样总大肠菌群数的含量，表明水被粪便污染的程度，而且间接地表明有肠道致病菌存在的可能。实验内容水样采集；菌落总数的测定；总大肠菌群的测定。一、水样采集采样原则所采集的样品具有代表性。采样容器：选择硼硅玻璃瓶和聚乙烯塑料瓶。不能是新的污染源；不吸收或吸附某些待测组分；不与待测组分发生反应。保证从采样到分析期间，样品各组分的浓度不发生改变。必须按一般无菌操作的基本要求采集，并保证在运送、贮存过程中不受污染。自来水水样：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min（经常用水的水龙头放水1～3min）后，采集水样于无菌锥形瓶，约占瓶容量80%，以便摇匀水样。水源水水样：选有代表性的地点及可疑地方，一般距水面下10～15cm采样。采样后，将瓶塞盖好，再从水中取出。注意事项严格无菌操作。做好标记：采得水样后应立即记录水样名称、地点、时间等项目。从速送检。水样从采集到检验不应超过2h，在0～4℃下保存不应超过24h。二、菌落总数的测定—平板菌落计数法（一）生活饮用水[器材与试剂]

无菌1ml吸管1支/组，无菌平皿3个/组，营养琼脂。[方法]水样摇匀20~25次，使细菌分散。倾注培养：无菌吸取1ml水样分别置于2个空平皿，另一个作空白对照。再倾注15ml琼脂（约45℃）于平皿中旋转，混匀待琼脂凝固后倒置37℃24h。菌落计数：用肉眼或放大镜检查，计数平皿内菌落数目。[结果分析与报告]计算平均菌落数：报告方式：菌落总数(cfu/ml)。cfu：colonyformingunits当检样的菌落数为l~100时，按实有数报告；大于100时，采用二位有效数字报告。国家标准（GB5749-2006）规定生活饮用水菌落总数每毫升不得超过100个。（二）水源水[器材与试剂]

无菌1ml吸管6支/组，无菌10ml吸管1支/组。无菌平皿9个/组，营养琼脂。90ml灭菌盐水1瓶（内置适量玻璃珠），9ml灭菌盐水管3支。[方法]

稀释水样：无菌吸10ml混匀水样注入90ml灭菌水瓶中,混匀成1:10水样。取1:10水样1ml注入9ml灭菌试管中混匀成1:100水样。同法稀释成1:1000,1:10000水样。[方法]

倾注培养：用1ml无菌吸管吸取2~3个适当浓度的稀释液1ml,分别注入无菌平皿中，每个稀释度应同时做2个平皿，另取一平皿作空白对照。再做倾注培养(方法同饮用水)。菌落计数：方法同饮用水。菌落总数测定[结果分黑析与报告赌]计算不同稀释沸度的平均菌余落数：稀释度收的选择和菌落轮总数报贡告方式值：首先选掀择平均爸菌落在古30～300之笋间者进行晋计算。计算方法轰和报告方涝式如表1神所示。表1稀司释度选择祖及菌落总拌数报告方招式例次不同稀释度的平均菌落数两稀释度菌落总数之比

菌落总数(cfu／m1)

报告方式(cfu／m1)10-110-210-312345678136527602890150多不可计27多不可计01642952713046501l305020466085135120—1.62.22————164003775027100150051300027030500<1×1016000或1.6×10438000或3.8×10427000或2.7×1041500或1.5×103510000或5.1×105270或2.7×10231000或3.1×104<10由表2可惹判定水质碰被污染的苏程度。表2一仇般水源水记中菌落总倚数与水清副洁程度的右关系水的类别最清洁水清洁水不太清洁水不清洁水极不清洁水菌落总数

cfu／m110~100100~10001000~1000010000~100000＞100000[注意事狂项]菌落总数窃测定中，朝应选择合公适的稀以释度进行。（生祖活饮用着水，国虏家标准数规定每术毫升不执得超过倚100键个，因帮此可以这直接吸去取1毫夹升到平米板进行额培养）各稀释管窄、相应平羞皿做好标记。包括扑：水样宿名称、舅稀释度叼、时间桑、小组喘。严格无增菌操作。进行刘水样稀承释时，采每一稀垮释度均幻玉需更换寄吸管。倾注时，像要注意营滑养琼脂刚的温度。倾入琼脂消后要混匀，待琼脂话凝固后倒置培养。三、总凯大肠菌械群的测博定

—部多管发脏酵法分为三冷步：初发酵蔬试验平板分足离复发酵证述实试验初发酵试少验：采用乳糖触蛋白胨培通养液37罩℃培养2士4h，观跑察产酸产气情况。平板分离：对阳性管毯培养物，掉接种于品唇红亚硫酸飘钠培养基娃或伊红美呀蓝培养基澡，观察菌落特搬征，并进激行革兰氏豆染色和镜检锦。复发酵证齐实试验：对典型和屑可疑菌落你，接种于服乳糖蛋白驼胨培养液画，进行复亡发酵证实试验，并根据润标准所附泪检数表报理告结果。产气初发酵崖、复发支酵试验克结果大肠菌台群EM谜B上菌乒落特征大肠菌煎群革兰晨染色形丙态（一）劣生活饮含用水[器材与炒试剂]2瓶50梅ml三倍蛾浓缩的乳已糖蛋白胨乒培养液（内有导管）,1践0支5m先l三倍浓泡缩的乳糖膜蛋白胨培到养液（内有导管）,10叔ml吸管胶1支,1帜00ml匀量筒1支追。EMB，吊革兰染液灶等。[方法]初步发曾酵试验：接种水样食总量为3昂00ml逐（100评ml2籍份，10剪ml1故0份，12支发妥酵管）。37稳℃培养倍24h竹。平板分梁离：将产酸痕产气及浪只产酸呢不产气爬(发酵乳糖)管接富种EM鸦B,居37℃件培养2钢4h，屠取典型户菌落作疾革兰氏鸣染色镜盟检。复发酵试燃验：革兰氏涨染色镜欢检为革兰阴性绞无芽胞杆届菌，取该菌槽接种于普漆通浓度乳蓝糖蛋白胨章(每管接星1~3个适菌落),免37℃异培养24快h，有产酸产震气者即证雷明有大罩肠杆菌睁的存在景。产酸产气报告为织大肠菌筹群阳性[结果分去析与报告愿]根据证实踪蝶有大肠菌艺群存在的传阳性管（味瓶）数，店查接种水星样总量示为30家0ml苗检数表（表3扇）。报告每升水市样中的交大肠菌系群数（MP腔N值天，Mo芹st狂Pro钉bab航le粪Num浙ber帽，最大案可能数寺法）。国家标准杏（GB5伞749-毙2006科）规定生杯活饮用水扬大肠菌数可每升不得笼超过3个械。表3惊大肠菌号群数检筝数表接种水样驼总量30疏0ml（杂100m挨l2份床，10m杨l10肃份）10ml水量的阳性管数100ml水量的阳性管数012每升水样中大肠菌群数每升水样中大肠菌群数每升水样中大肠菌群数0l2345678910＜33711141822273136404813182430364351606911182738527092120161230＞230（二）水晨源水[器材希与试剂叹]1ml礼吸管3膝支/组周，10那ml吸唯管1支轨/组，向10m填l普通棒发酵管殃（内有警导管）茫3支/捧组，5芹ml三董倍发酵款管（内寨有导管沫）1支而/组。EMB，时革兰染液梨等。[方法]稀释水宰样：水样做逼1:1枪0及1领:10漫0稀释激。方法桐同菌落属总数测详定。初发酵试文验：接种水鞠样总量挑11.握11m友l，4支发城酵管。珍取10早ml原锻水样注昂入5m垦l三倍闹乳糖发倒酵管（捐内有导朝管）；虏取1m泛l原水盾样、1愤ml烫1:1钩0及1督:10伸0稀释再水样分聚别注入愁10m熟l普通利乳糖发反酵管（象内有导沈管），销37℃梳培养2假4h。平板分离寺与复发酵驾试验：同生活迷饮用水捐。[结果分暖析与报告谣]根据证实族有大肠菌访群存在的董阳性管（脚瓶）数，饼查接种水样爪总量为1域1.11比ml检数茎表（表4）眼，报告每遮升水样中海的大肠菌霞群数。表4止大肠菌虽群数检唤数表接种水棉样总量食11.海11m糟l（1史0ml乳、1m袖l、粥0.1购ml、宵0.0请1ml星各1功份）接种水样总量(ml)每升水样中大肠菌群数1010.10.01－－－－－－－＋－－－＋－＋＋－－＋＋－＋－－－－＋＋－－－＋＋－＋＋－－－＋＋－＋地＋－＜９０９０９０９５１８０１９０２２０２３０２８０９２０９４０[注意侧事项]总大肠劳菌群的储测定方魔法，由例于饮用苏水和水掉源水可搞能的污柱染程度叛不同，青因些采用不眼同的接票种量，蔑检数表祖也不相习同。当接种量超崭过1毫升时，一般采用多怕倍浓度君培养液。如配恐制3倍森浓缩乳桨糖蛋白普胨培养拖液50披mL，帜加入1兼00m首L水样贱后，总臣体积为或150骑mL，贫培养液左恢复到巴正常浓禁度。做好标记。严格无颂菌操作。每一稀条释度均需罩更换吸管独。实验安排当日：竞水样采供集、倾注培养、初发弓酵试验祖。第二日槽：菌落计屯数及结基果报告、平板鹅分离。第三日：滚涂片，革特兰氏染色雨，镜检、玩复发酵试绣验。第四日：嫁报告大肠灿菌群数。