微生物第七章-

第七章微生物的生长及其控制第一节微生物生长规律第二节影响微生物生长的环境因素第三节微生物生长的控制方法第一节微生物的生长规律7.1.1微生物的培养和群体生长7.1.2生物量测定方法7.1.3微生物的生长规律7.1.4生长参数和生长过程控制7.1.5维持稳定生长的方法微生物的培养：在实验室或在工业上，使用培养基和培养容器，在特定培养工艺和培养条件下，人工培养微生物，获得微生物菌体或代谢产物的过程；在培养过程中，微生物的个体生长表现为细胞组分的均衡增加，细胞形态略有增大；微生物的繁殖导致个体数量或生物量有规律的增长，表现为群体的生长；群体生长与培养条件（培养基和环境因素）密切相关；7.1.1微生物培养和群体生长在人工培养条件下培养微生物，通过繁殖而得到的微生物群体称为培养物（culture）；只有一种微生物的培养物，或者由单个细胞繁殖得到的微生物群体，称为纯培养物（pureculture），简称纯培养；微生物的实验室培养和工业发酵，一般都是纯培养；微生物由于个体微小，很容易混杂，需要经常性的进行菌种纯化，以获得微生物的纯培养；微生物的纯培养平板单菌落分离法：使微生物的单细胞或单孢子充分分散，彼此分开，然后涂布在固体平面培养基上，培养后长出的单菌落，很可能是由一个细胞或孢子繁殖形成的纯培养；平板划线法分离法稀释涂（倒）平板法显微操纵器分离：借助显微镜和显微操作工具，直接分离单细胞（单孢子），然后接种培养；纯培养的分离方法用接种环取一环菌悬液或菌苔，在平板上划线；每画一组平行线，灼烧接种环一次；反复划线、可拉出单细胞；平板划线法分离法

稀释涂（倒）平板法将待分离材料制备成悬液，使细胞或孢子充分分散；用10倍稀释法稀释，取适当浓度的稀释液，涂布平板或与培养基混合后倒平板：涂平板加菌悬液0.2mL倒平板加菌悬液1mL微生物的培养方法根据培养基物理状态和培养规模，好氧微生物培养方式分为：固体斜面培养、固体平板培养、茄子瓶培养、大规模固体发酵；半固体试管培养；摇管培养、摇瓶培养、小型发酵罐培养、大规模深层搅拌液体发酵；实验室培养厌氧菌需要驱除和隔绝氧气；工业厌氧液体发酵；在微生物生理代谢基础研究，或者微生物工程应用中，大多使用发酵罐（生物反应器）进行液体培养；分批培养（batchculture）：指恒定体积的液体培养，从接种开始，直到培养结束，在培养过程中不补充营养，也不移出培养物；流加分批培养：在培养过程中，不断流加营养物，培养体积不断增加；连续培养：在培养过程中，不断流加营养物，同时不断移出培养物；发酵罐微生物液体培养方式微生物工业发酵过程发酵工程包含三个过程：上游技术（微生物遗传育种技术）、微生物发酵过程和下游技术（分离工程）；微生物发酵过程包含同时进行的微生物培养过程和微生物反应过程；在工业微生物发酵过程中，既要控制微生物的生长，又要控制微生物的代谢；通常的微生物培养仅需要控制微生物的生长；控制微生物生长，必需了解微生物的生长规律，清楚影响生长的主要因素；青霉素G的发酵生产工艺——发酵（反应）过程种子培养：产生健壮和大量的种子；产黄青霉接种到固体培养基上，在25℃下培养7天，收获产黄青霉的孢子；将孢子洗脱下来，制备孢子悬液，接种到液体种子培养基中，在27℃下，种子罐通气搅拌培养24h；发酵培养（微生物反应）：获得大量次级代谢产物；将种子培养液接种到发酵罐中，在27℃下，通气搅拌培养7天，期间流加苯乙酸，作为合成青霉素的前体物；种子扩大培养和发酵的工艺流程和工艺条件工业发酵：通过控制微生物的培养条件，使微生物正常生长，并大量积累目标代谢产物；平面培养一级种子罐培养摇管培养摇瓶培养二级种子罐培养发酵培养7.1.2生物量测定方法微生物培养物的定量测定，称为生物量测定；测定对象不同，方法不同，单位也不同，但可互相校正；显微镜直接计数法：测单细胞或单孢子；平板菌落计数法：测单细胞或单孢子；细胞湿重和干重法：测定单细胞或丝状微生物；分光光度法：测单细胞或单孢子；生理指标法：测定单细胞或丝状微生物；显微镜直接计数法显微镜直接计数法：是在显微镜下，用血球计数板对单细胞或单孢子直接计数，单位为：个数/mL；显微镜直接计数法不能区分死菌与活菌，称为全菌计数法；血球计数板是一块特殊的载波片，在中间的两个平台上各刻有一个大方格网；大方格网由九个大方格组成，中间的正方形大方格为计数室；计数室边长1mm、高0.1mm，体积0.1mm3

（10-4ml）血球计数板的结构计数室平台方格网方格网计数室被划分为25个中方格，每个中方格分为16个小方格，共400个小方格；上面盖上盖玻片；血球计数板的使用方法浓度约108个细胞/毫升的菌悬液，滴加在盖玻片与血球计数板平台的结合处，使菌悬液经毛细作用吸入计数室，静置，使细胞沉底；计数若干小格内的细胞数，计算每小格平均数，则：菌浓（个/ml）＝每格平均数×400×104×稀释倍数将待测菌悬液适当稀释后，涂布在平面培养基上，培养后进行菌落计数，一个菌落相当于一个活细胞；平板菌落计数属于活菌计数法，适用于单细胞或单孢子计数，单位：菌落形成单位/mL（cfu/mL）（colonyformingunit，cfu)平板菌落计数法选择生长50～300个单菌落的平板进行计数，结果准确；平板菌落计数方法10倍稀释法制备待测菌悬液，选择适当的稀释度，定量（0.1~0.2mL）取稀释液涂布平板，或者定量（1mL）取稀释液与融化后冷却至45℃的培养基混合倒平板；培养后，对长出的单菌落计数，根据稀释倍数，得到原菌液的生物量：cfu/mL通常选择三个稀释度涂平板，择其合适者计数；单细胞或丝状微生物的生物量均可用直接测量湿重或干重的方法测量；离心收集细胞沉淀，无菌水充分洗涤后，直接分析天平称重—湿重（mg/ml）；洗涤后的细胞沉淀在105℃下烘干至恒重，分析天平称重—干重（mg/ml）；培养液菌体湿重约40g/L，干重约4mg/mL；湿重受培养基成分影响大，而不准确；干重法费时，灵敏度低，适于测定丝状微生物：细胞湿重和干重法在一定范围内，菌悬液的菌体浓度与一定波长下的光密度值（opticaldensity,OD值）呈线性关系；用分光光度计，在600nm波长下，测定菌悬液的OD600值，或吸光度值（A600），可校正为1OD=n个细胞/mL；分光光度法OD值在0.2~0.8之间呈线性关系；适用于单细胞或单孢子悬液的生物量测定；在不方便圣使用显微沾计数、平贸板菌落计斧数、细胞施湿重和干核重测定、滩分光光度求测定生物投量的情况掠下，可测允定与生物宣量成比例奇关系的细侍胞总蛋白暂量，总核冒酸量，或灭者呼吸强兆度，间接半测定总生晃物量，称羡为生理指摸标法；测定总闷蛋白：四凯氏定云氮法测酬定测总核酸补：定磷法像测定测呼吸强夏度：CO2产生量（和速率）生理指却标法生长规茂律：二胡分裂殖等的单细洁胞微生垃物在分饮批培养愚过程中象，其生狸物量的妹增长随英培养时齿间的变锄化规律耗：即生蚕长过程招表现出裤延迟期情、指数呼生长期粪（对数唐期）、原稳定期江、对数佳衰亡期做（死亡缸期）的歼规律变艇化；非二分裂肤殖或非单怎细胞的微锐生物在分匪批培养过克程中，生蚊长规律类影似，但不三典型；一般通令过绘制遭微生物授培养过夫程的生搂长曲线明，反映逆其生长滋规律和尚生长参槽数；7.1.困3微生物午的生长激规律微生物的部生长曲线生长曲线线：在项分批培姻养中，粥以微生需物的生郊物量为供纵坐标顿，以培晋养时间把为横坐补标绘制血的曲线撑图，反这映生物挣量随培晌养时间稠的变化掩；对于二增分裂殖处的单细寺胞微生扔物，用者细胞数汪量的对刃数值为梅生长曲悄线的纵弯坐标；对于其它种微生物可侮用培养液下的OD值或者细盼胞干重作作为纵坐标服；在确定副的液体正培养条拘件下，虾接种后脚，每隔虾一定时里间取样佩，测定灭生物量送，至培阳养结束浴；用生孕物量对还培养时服间作图漂，得到久某种微替生物在盾特定条很件下的齿生长曲酒线；生长曲线剑的绘制方购法实线为勇活菌计君数，虚餐线为总赖菌计数延迟期惊和指数题生长期延迟期破（lag曲phas职e）：培五养的最兆初阶段蓬，生物宽量不随质培养时畏间增加穿；此阶段，服细胞繁殖罢速率很低曾，细胞处捏于吸收营却养，调整界代谢的生播理阶段；此阶段，杜细胞繁殖鲜速率最大扩且稳定，山细胞代谢送旺盛生理光状态均一想；对数期（log派phas共e）或指稀数生长幅期（expo兄nent非ial判grow贷thp放hase）：生薯物量随亿培养时膊间呈指铃数曲线商增长；稳定期稳定期（sta虾tio震nar普yp商has姻e）：生物找量保持稳拘定，不随求培养时间剪变化，此夜阶段，细锯胞繁殖速担率与死亡庭速率相同态，活细胞该量处于动屈态平衡；生长到稳漆定期，培向养基中的阳营养物消恒耗、代谢粉废物积累绵、环境条恶件改变；部分细忌胞开始茧衰老、恩死亡和哑自溶裂奶解，细烦胞形态蛛多样、颤生理状受态不均倡一；衰亡期衰亡期或婶对数衰亡杯期（log贩ari无thm晨ic页dec留lin臭ep液has搭e）：活渴细胞数俩量随培防养时间婚呈指数雁曲线下赛降，细索胞几乎俭停止繁博殖，而室死亡速留率达到良最大；此阶段，猜营养物耗悟尽、有毒丑代谢物积窗累、环境贞恶化；多数细胞止进入衰老险、死亡和挡自溶状态遗，细胞多悦畸形，活故细胞数量俯降低；7.1.违4生长参数和川生长过角程控制描述生离长过程尝的参数阁：延迟期的腊长短；指数期孝的代时蛛和最大哄比生长鼠速率；稳定期的立长短、最湖大生物量线和生长得蛇率；可通过小一定方鼓式控制研这些参包数而控认制生长荷过程；延迟期是休眠细答胞的活化曾期，或者粉是细胞代舱谢系统与脑营养和环睛境条件的甜适应期；在工业发伙酵中有必更要采取措捆施缩短延宣迟期，而倦缩短发酵倾周期：使用活化今的新鲜培副养物作为敏菌种；使用营班养丰富席的天然突培养基却，或速史效碳、驾氮源；使种子培名养基与发轨酵培养基及的营养物旱质成分相繁近；增大接种倦量，缩短控延迟期；延迟期饥长短的畜控制指数期是为细胞以稳姻定（最大府）速率繁姨殖的阶段础，繁殖速姨率可用代福时或倍增羞时间表征吓；代时（gen蛙era愈tio嫂nt肚ime，G）：二猜分裂殖械的单细露胞微生俘物在指腹数期繁泄殖一代社（分裂亿一次）浅所需要联的时间狠；倍增时间瓶（dou肢ble享ti加me，D）：非肚二分裂字殖或丝膜状微生勒物在指纷数期生艳物量增淹加一倍旺所需时隐间；代时或词倍增时突间越短油，表明客微生物笋的生长叮（繁殖讲）速率行越快；专代时或余倍增时床间与培融养条件谎相关；指数期头的代时或枪倍增时短间(G)代时和倍增顺时间的测定截方法二分裂殖伶单细胞微金生物的生叮长曲线纵弱坐标上选扒择指数期泪内细胞数丈量为倍数私关系的两孟点，其对青应横坐标角两点之差南为代时；非二分架裂殖火陵丝状微革生物在挤生长曲种线纵坐滴标上取通生物量雹为倍数矛关系的起两点对言应的时豆间差为旷倍增时茶间；N0：初始细胞诸量；Nt：t时间的鄙细胞量;n：从0~t时间内繁剂殖的代数二分裂毅殖单细榨胞微生砖物代时的计算公式G=————tt–t0tt–t0n=————————3.322(logNt－logN0)微生物在锁确定培养条件下节的代时（倍增友时间）Vib傍rio厌na六tri呜ege芒ns柱胞鱼耽腥藻桃褐腐病挎菌巢状组囊拴藻比生长肠速率（m）：在断确定培牲养条件垂下，在病微生物揪指数生放长期，际单位生羽物量单甘位时间东内的增暂加量为亿常数，替或细胞窃瞬时增书长量与拒此时细仇胞量的曲比值是喝一个常沾数，表宅征各种悄微生物势的生长岗速率：dN/d瞒t＝mN（m的单位：mg/m羽g·h＝h-）lnNt-ln处N0＝m(tt－t0)logNt-lo就gN0＝m(tt－t0)/该2.香303μ＝(令log碌Nt－log贞N0)×2.既303辽/(tt－t0)比生长速才率（m）的计算∵G沟=（tt-t0）／3.托322（释logNt－log嫌N0）m＝（log宰Nt－lo决gN0）×2.3豪03/（般tt－t0）∴G屈＝2.3土03／3收.322mG＝0臂.693胜／m在指数生因长期，比滴生长速率雹达到最大丈且稳定；德代时（倍聚增时间）衣最短且稳塘定；某种微调生物的墨比生长刷速率或荣代时，桃决定于持生长的懒营养和息环境条挺件，是义可以控抗制的；代时或倍增时羽间与比生家长速率烟的换算关系稳定期持续时间闹的延长生长到达杂稳定期后掏，营养物来质浓度降桐低程度、才有毒代谢刑废物的积楼累量、环坡境恶化程泪度决定稳修定期的长王短；在发酵工筛业中，生炒产次级代惠谢产物需获要尽量延证长稳定期王，以便达脏到最高发向酵单位；一般采蚁用补充至营养物加，移出聪部分代派谢产物功的半连蒸续或连牢续发酵镰方式，博以及控替制pH值，提高膝通气量等剂方式延长垮稳定期；培养到刻稳定期葛时达到剃了最大闸生物量禽，以湿纺重或干叉重g/胳L表征卷；影响也最大生尘物量的瞒主要因偿素是培喇养基中详营养物源的浓度烦；生物量（g）碳源消耗量（g、mol）Y＝稳定期的最大生物量和生是长得率生长得率（Y）：消耗遇单位量的傅营养物质主（碳源）岁所获得的广生物量；挪好氧菌一惩般Y值约为0.2攻0～0.50；限制性肉营养物援浓度与m和最大去生物量的关系限制性营不养物：生估长必需的笔某种营养睡物（碳源射、氮源、唐生长）在已培养基中候限量提供宿，也称为蹈生长限制贝性因子；限制性营毒养物浓度趋与最大生辫长量呈线借性关系；破与比生长嚷速率