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文档简介

实验十四

碱裂解法制备Bcl-2重组质粒DNA

细菌基因组DNA与质粒DNA的比较细菌基因组DNA质粒DNA

pH12.6

变性不完全变性pH调至中性不完全复性复性

离心沉淀上清

结构

大的环状dsDNA

局部松散结构

小型环状dsDNA

超螺旋结构原理碱裂解法中溶液I、II、III的作用溶液I(细胞悬浮液)

50mmol/L葡萄糖

10mmol/LEDTA-Na225mmol/LTris-HCl(pH8.0)葡萄糖:增加溶液的粘度，悬浮细胞，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力而降解EDTA:螯合Mg2+、Ca2+，抑制DNase

溶液II(裂解液)

0.2mol/LNaOH1%SDSNaOH:裂解细胞使基因组DNA、质粒DNA和细菌蛋白质变性(pH12.6)SDS:阴离子表面活性剂溶解细胞膜的脂类和蛋白质，破坏细胞膜与蛋白质结合成复合物，使蛋白变性（为沉淀做铺垫）

会抑制RNase，下一步需除去(临用时1:1配制)3mol/LKAc2mol/LHAc溶液III(中和液)KAc-HAc缓冲液(pH4.8):

把抽提液调回pH至中性，使变性的质粒DNA复性，并稳定存在；钾取代了SDS中的钠后形成了不溶于水的十二烷基磺酸钾(PDS)高盐的KAc有利于变性的基因组DNA、PDS-蛋白质-细胞壁复合物凝聚而沉淀沉淀基因组DNA和蛋白质操作步骤（2人/组）1.取菌液1ml

，10000r/min，离心2min，弃上清，扣干溶液。2.加入溶液I100μl，涡旋混匀*，静置5min。3.加入新鲜配制的溶液II200μl，颠倒混匀*，冰浴5min。4.加入溶液III150μl，颠倒混匀，冰浴5min。5.12000r/min，离心5min，吸取300μl上清转移至另一1.5mlEP管中。6.加入2倍体积(600μl)无水乙醇，颠倒混匀，冰浴5min。12000r/min，离心5min，弃乙醇。7.加500μl70%乙醇洗沉淀，12000r/min离心5min，弃乙醇。室温静置5min。8.加入20μlTE缓冲液，待DNA沉淀溶解后，做好标记保存于-20℃。注意事项

1.第1步弃上清时尽量使所有的液体流出。

2.溶液II要新鲜配制。3.加入溶液II时禁止涡旋振荡，冰浴时间不能太长。4.DNA沉淀不要太干燥，否则难溶思考题

1.溶液II为何要新鲜配制，加入溶液II时为何不能涡旋振荡，冰浴时间为何不能超过10min？

2.溶液II中高浓度的NaOH可使蛋白质

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