rqpcr技术的原理及临床应用

rqpcr技术的原理及临床应用rqpcr技术的原理及临床应用第1页实时荧光定量PCR定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析方法。rqpcr技术的原理及临床应用第2页

与普通PCR区分

普通PCR技术：在PCR结束后对终点产物进行定量分析。实时定量PCR技术：实时检测PCR扩增，在扩增指数期对起始模板进行定量。rqpcr技术的原理及临床应用第3页rqpcr技术的原理及临床应用第4页荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定一个值，它能够设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，普通荧光阈值设置是基线（背景）荧光信号标准偏差10倍。每个反应管内荧光信号抵达设定阈值时所经历循环数被称为CT值（thresholdvalue）。rqpcr技术的原理及临床应用第5页rqpcr技术的原理及临床应用第6页rqpcr技术的原理及临床应用第7页

荧光定量PCR化学原理

非特异性荧光标识：

1、SYBRGreen

特异性荧光标识：

2、TaqManrqpcr技术的原理及临床应用第8页1、SYBRGreen法rqpcr技术的原理及临床应用第9页SYBRGreen熔解曲线分析

rqpcr技术的原理及临床应用第10页溶解曲线溶解曲线分析能够用来确定不一样反应产物，包含非特异性产物。扩增反应完成后，经过逐步增加温度同时监测每一步荧光信号来产生溶解曲线，伴随反应中双链DNA变性，荧光染料又回复到游离状态造成荧光信号降低，用荧光信号改变负一次倒数与温度作图，在扩增产物溶解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50％温度），用这个特征峰就能够将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不一样温度溶解.rqpcr技术的原理及临床应用第11页SYBRGreen法优缺点优点:对DNA模板没有选择性适合用于任何DNA使用方便--无须设计复杂探针非常灵敏廉价rqpcr技术的原理及临床应用第12页2、TaqMan探针法

rqpcr技术的原理及临床应用第13页TaqMan作用机理

rqpcr技术的原理及临床应用第14页

TaqMan法优缺点

rqpcr技术的原理及临床应用第15页Real-timePCR临床应用rqpcr技术的原理及临床应用第16页荧光定量PCR在病原体检测中应用一肝炎病毒定量检测二性病病原体检测三结核杆菌及呼吸道病原体检测四优生优育(TORCH)相关项目检测临床应用rqpcr技术的原理及临床应用第17页HBV（二）HBV-DNA与“两对半”1.“两对半”：机体免疫反应状态；2.“携带者”、“大三阳”、“小三阳”等免疫学指标不能反应体内病毒复制水平与感染程度。FQ-PCR：检测是HBV本身遗传物质—DNA，是病毒存在和复制最可靠、最直接指标。rqpcr技术的原理及临床应用第18页3.血清学指标(－)不能排除HBV感染。

HBV（二）HBV-DNA与“两对半”HBsAg(－)

HBV-DNA(＋)

HBeAg(－)HBV-DNA(＋)4.也可能出现HBsAg(＋)，HBV-DNA(－)。5.HBsAb(＋)、HBcAb(＋)、HBeAb(＋)三抗体阳性与HBVDNA2.5×103copy/ml结果解释。rqpcr技术的原理及临床应用第19页rqpcr技术的原理及临床应用第20页(1)HBV基因变异，如S区和前S区变异，可影响HBsAg表示或改变其抗原性；(2)HBV-DNA基因重排：HBV-DNA基因整合到宿主染色体中，可造成DNA序列重排，进而影响HBsAg表示。(3)患者原因：患者处于HBV感染恢复早期，体内HBsAg水平很低，或患者体内存在长久低水平HBV复制，采取普通酶联免疫吸附试验不能检出。(4)HBsAg免疫复合物形成：免疫复合物中抗体封闭复合物内抗原，试剂中抗体不能与复合体内抗原结合，从而致HBsAg假阴性结果。

rqpcr技术的原理及临床应用第21页HBV(三)

HBV-DNA定量检测临床意义3.HBV-DNA定量与预后

a.含量高者急性肝炎患者易慢性化

b.癌变几率显著高于含量低者1.HBV-DNA定量与HBV复制水平及传染性2.HBV-DNA定量与乙肝药品疗效a.教授提出<103copy/ml做为阴性或临床治愈标准b.HBV-DNA定量分析与干扰素治疗(前、中、后)c.拉咪呋啶rqpcr技术的原理及临床应用第22页HBV(三)

HBV-DNA定量检测临床意义4.HBV-DNA定量有利于指导怀孕与孕期，哺乳期检验5.肝脏移植与HBV-DNAMazzaferro等汇报：<103copy/ml无一例再发肝炎

>105copy/ml发生了严重HBV再感染6.血液制品和献血员筛选rqpcr技术的原理及临床应用第23页二常见性传输疾病病原体一淋球菌（NGH）二沙眼衣原体（CT）三解脲脲原体（UU）四梅毒螺旋体（TP）五单纯庖疹病毒（HSV）六乳头瘤病毒（HPV）七人类免疫缺点病毒（HIV）八EV71A16通用型rqpcr技术的原理及临床应用第24页1.非培养或形态学检验诊疗技术，快速、特异、敏感。2.对无症状或症状轻者，能够早期确诊。3.对NGH、CT、UU等混合感染者，诊疗和判别诊疗。4.指导用药、考评疗效。

荧光定量PCR诊疗NGH/CT/UU意义NGH/CT/UUrqpcr技术的原理及临床应用第25页NGH/CT/UU荧光定量PCR诊疗NGH/CT/UU意义5.不孕不