乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座

乙型肝炎病毒cccDNA

——检测方法与应用价值第二军医大学长征医院缪晓辉

.10乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第1页一、几个相关问题介绍乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第2页什么是HBVcccDNA?即共价闭合环状DNA（covalentlyclosedcircularDNA)。乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形成、结构完整、超螺旋双链DNA分子。乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第3页乙型肝炎病毒基因组结构示意图乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第4页乙型肝炎病毒复制过程乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第5页我们为何要关注HBVcccDNA?cccDNA存在于细胞核内，成为乙肝病毒复制“池”当前尚没有能够进入细胞核内，并能够去除cccDNA药品，这也是现有抗病毒药品治疗效果不佳和治疗后轻易复发原因之一肝脏以外器官组织细胞可能存在cccDNA，成为肝脏移植术后乙肝复发起源还没有稳定、可靠、敏感cccDNA检测试剂盒问世乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第6页为何没有cccDNA检测试剂盒问世?·研究和开发该检测技术时间不长·检测技术上难度较大·前期研究主要集中于细胞模型和动物肝脏模，不能满足临床检验需求·现有技术灵敏度不高，检测低限104copy/ml左右·分研究机构和学者对检测技术特异性认识不足，存在缺点乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第7页·各种同源乙肝病毒DNA分子并存(cccDNA、rcDNA、ssDNA、整合HBVDNA），必须有效地分离cccDNA和其它类型病毒DNA·怎样深入处理特异性问题？·怎样处理灵敏度不高问题（细胞内cccDNA含量较低），血清中含量？·怎样简化检测步骤？建立cccDNA检测技术必须克服难点乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第8页cccDNArcDNA核酸一级结构完整双链两条链均不完整核酸空间结构闭合环状，超螺旋松弛环状，非超螺旋是否与蛋白质结合不结合共价结合对一些核酸酶抗性强，不轻易被降解弱，轻易被降解分离cccDNA和rcDNA分子基础分离cccDNA和rcDNA任何伎俩均基于上述差异乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第9页二、HBVcccDNA检测技术乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第10页1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者探针法（Invaderassaay）3.嵌合引物荧光PCR法现有几个cccDNA检测技术介绍乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第11页现有几个cccDNA检测技术介绍选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者探针法（Invaderassaay）3.嵌合引物荧光PCR法乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第12页设计一对特殊引物：跨双缺口引物

正义引物P1：与负链互补结合，位于正链缺口上游反义引物P2：与正链互补结合，位于负链缺口下游目标：rcDNA不被扩增1.选择性PCR乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第13页选择性PCR：rcDNA不被扩增乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第14页选择性PCR：cccDNA能被扩增乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第15页PCR产物本身退火（selfannealing）“选择性”PCR：并非万无一失乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第16页国内外许多研究者忽略了这个问题，rcDNA被大量扩增，阳性结果不可靠，定量结果也不可靠HepatologyResearch;15:234-243（PBMC）WorldJGastroenterol;10(1):82-85(血清)Kock等：反应管中rcDNA含量不能超出105copyHepatology

1996;23:405-413我们经验：血清HBVrcDNA超出108copy/ml，进行荧光PCR可能会出现检测结果假阳性“选择性”PCR：并非万无一失乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第17页与定性法比较增加了一个荧光探针，探针位于扩增片段区（负链缺口下游），与cccDNA负链互补。选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第18页rcDNA不能被扩增无荧光信号EcoRI5‘+P1P23200(1)5‘3‘15903‘1820P118201590+3200（1）EcoRIP2cccDNA能被扩增检测到荧光信号选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第19页实时荧光定量PCR原理乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第20页实时荧光定量PCR原理乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第21页实时荧光定量PCR原理乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第22页标准曲线方程YCt=42.0827-3.5554logXcopy相关指数：R2=0.995灵敏度最少能够到达103copy/ml我们结果：选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第23页·一样存在PCR产物本身退火引发rcDNA非特异性扩增问题·因为灵敏度较普通PCR高，假阳性率比普通PCR更高缺点：选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第24页质粒标准品107copy/ml3.5×108copy/ml携带者血清质粒标准品105copy/ml105~107copy/ml携带者血清选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第25页处理方案特异性抽提分离cccDNA与其它形式病毒DNA采取沉淀法或质粒抽提试剂盒抽提法酶切纯化cccDNA采取绿豆核酸酶或ATP依赖plasmid-safeDNA酶选择性实时荧光定量PCR检测cccDNA乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第26页1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)侵入者探针法（Invaderassaay）3.嵌合引物荧光PCR法现有几个cccDNA检测技术介绍乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第27页2.侵入者探针法(Invaderassay)两个体系：两种特殊探针：invaderprobe和primaryprobe，后者含与待测模板无关5’侧翼碱基片段。荧光共振能量转移系统：被核酸内切酶Ⅰ(cleavase,裂解酶)特异地切割5’侧翼碱基片段作为第二个invader，与荧光共振能量转移盒（FRETC）结合，裂解酶切割FRETC上含有荧光基团短臂，发出荧光信号。特点：一个模板能够重复使用，每“结合—裂解—结合—裂解”一次为一个循环，每循环一次产生一个荧光信号，呈线性信号放大乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第28页乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第29页乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第30页侵入者探针法定量检测cccDNA优缺点优点：线性信号放大，特异性比荧光PCR法强缺点：灵敏度低：104copy/ml乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第31页1.选择性PCR(普通PCR、套式PCR、荧光PCR)2.侵入者分析法（Invaderassaay）嵌合引物荧光PCR法现有几个cccDNA检测技术介绍乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第32页3.嵌合引物荧光PCR法Shao,etal.JVirolMethods；112：45-52+PNN：与HBVDNA非同源片段5’N5’3’3’p+rcDNAcccDNA乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第33页PNNP25’3’5’3’3.嵌合引物荧光PCR法乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第34页

嵌合引物荧光PCR优缺点

优点：克服了荧光PCR法部分缺点，灵敏度比侵入法提升

缺点：仍不能完全防止待测标本中存在rcDNA被非特异性扩增乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第35页

不论是选择性荧光PCR，还是侵入者探针法或嵌合引物荧光PCR，本身都不能处理在高rcDNA背景条件下假阳性问题，必须结合抽提分离、酶切纯化等步骤，以提升特异性。乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第36页三、影响cccDNA池原因乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第37页1.cccDNA池本身恒定cccDNA池：感染肝细胞核内HBVcccDNA含量在无外来干扰情况下保持恒定(5－50copy/cell)病毒本身调整：关于病毒进化关于病毒“思维”病毒本身调整外来压力：打破病毒含量本身恒定结果乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第38页2.抗病毒药品对cccDNA影响现有抗病毒药品，包含干扰素和各种核苷类似物，能够一过性地降低cccDNA，但均不能去除cccDNA细胞核内cccDNA含量相对稳定性，决定了长疗程抗病毒治疗必要性乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第39页抗病毒药品研究者模型干扰素Schultz等原代鸭肝细胞拉米夫定Mason等土拨鼠Addison等北京鸭阿德福韦Dandri等土拨鼠Delmas等北京鸭L-Fd4CZoulim等原代鸭肝细胞抗病毒药品对cccDNA影响（文件举例）乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第40页阿德福韦治疗48周结果Hepatology;42:302-308举例乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第41页3.肝外组织也是cccDNA储存池？·肝外组织细胞中HBV标志存在情况：肾、胰腺、肺、心肌、心包膜、胃肠黏膜、皮肤、睾丸、前列腺、唾液腺、PBMC等组织或细胞中均检测到HBV标志物·HBV吸附？暂居？建立感染状态？依据：从上述组织细胞中检测到cccDNA，但必须处理检测技术问题乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第42页(1)相关PBMCs中cccDNA检测研究结论研究者发表杂志PBMCs中不存在cccDNAKock等Hepatology1996刘茂昌

等中华肝脏病杂志PBMCs中存在cccDNA赵克开、郝勇等Stoll-Becker未发表J.Virol1997CabrerizoHepatologyToriiHepatolRes乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第43页PBMCs中cccDNA检测结果不一原因·方法学问题:假阳、阴性率？灵敏度？

当前报道阳性结果者均采取套式PCR！·研究模型选择？·病毒原因？·细胞数量多少？·其它：免疫功效状态、试验室条件等乙型肝炎病毒cccDNA检测方法与应用价值专家讲座第44页