蛋白质定量及脂蛋白电泳

蛋白质定量及脂蛋白电泳第1页/共30页实验目的1.掌握双缩脲法及Lowry氏法测定蛋白浓度的原理;2.学会使用分光光度计;

第2页/共30页实验原理1、分光光度法及比色分析法2、Lambert-Beer定律3、颜色反应第3页/共30页分光光度法及比色分析法

应用分光光度计测定溶液的吸收光谱及其对某一波长光线的吸收能力，可以作为物质定性或定量检查的方法,称为分光光度法。第4页/共30页

紫外分光光度法

比色分析法（可见光分光光度法）红外光谱法荧光光度法化学发光分析法分类：第5页/共30页一、物质对光的选择性吸收和吸收光谱（一）物质的颜色和光的波长的关系光是一种电磁波；自然光是由波长不同的电磁波组成的混合光，在400-760nm范围。第6页/共30页光的互补色示意图(/nm)绿500~580nm黄580~600nm紫400~450nm白光青490~500nm橙600~650nm红650~750nm蓝450~480nm青蓝480~490nm物质的颜色实质是它所吸收的色光的互补色。第7页/共30页吸收黄光透过蓝光白光→人眼CuSO4实验证明：CuSO4溶液浓度越高，对黄色光的吸收越多，表现为透过的蓝色越强，溶液的蓝色也越深。比较溶液颜色的深浅，实质比较溶液对光的吸收程度互补色光——如：黄光和蓝光；紫光和绿光。第8页/共30页（二）吸收光谱曲线吸收光谱曲线横坐标；纵坐标A。最大吸收波长—max

同种物质：

C不同，max相同max第9页/共30页二、Lambert-Beer定律I

I0

单色光透光度

T=I/I0

D=－LgI/I0=KCL

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D值：光密度（OD.）表示溶液对光线的吸收量。亦称为吸收度（A）

C：溶液的浓度

L：溶液的厚度

K：常数，称为消光系数表示物质对光线吸收的本领取决与物质的种类和波长。D=KCL

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单色光稀溶液吸收峰值(λmax)

稳定的溶液Lambert-Beer定律的适用条件第12页/共30页三、比色分析法许多物质本身具有一定的颜色，也有许多物质本身无颜色在加入适当的显色剂后生成有色物质。溶液浓度越大，颜色越深。因此可以利用比较溶液颜色深浅的方法来测定有色溶液的浓度。比色分析法：用可见光光源测定有色物质，也称为可见光分光光度法。以Lambert-Beer定律为基础第13页/共30页比色分析法当溶液的厚度不变(L)对于同一物质和同样波长的单色光，即消光系数不变(K)溶液的光密度和溶液的浓度成正比。即：D1/D2=C1/C2D=KCL第14页/共30页1、标准管法：D1/D2=C1/C2

（比色分析法的依据）2、标准曲线法：分析大批样品时。3、利用消光系数计算。

计算方法：第15页/共30页分光光度计

光源

单色光器

吸收杯测光机构第16页/共30页操作一Lowry氏法测定蛋白质含量

——标准曲线法1、实验原理2、操作步骤3、计算方法4、试剂及器材第17页/共30页操作二双缩脲法测定血清总蛋白

——计算法3、计算方法1、反应原理2、实验步骤4、试剂及器材第18页/共30页实验十二

血清脂蛋白的琼脂糖凝胶电泳第19页/共30页理论知识血浆脂蛋白

血脂与血浆中的蛋白质结合，以脂蛋白形式而运输。血脂包括：TG、ch和FFA等蛋白质：载脂蛋白(apolipoprotein)第20页/共30页乳糜微粒CM极低密度脂蛋白VLDL低密度脂蛋白LDL高密度脂蛋白HDL血浆脂蛋白的分类第21页/共30页血浆脂蛋白的结构疏水性较强的TG及胆固醇酯位于内核。具极性及非极性基团的载脂蛋白、磷脂、游离胆固醇，以单分子层借其非极性疏水基团与内部疏水链相联系，极性基团朝外。第22页/共30页

电泳的基本原理1、概念

指带电颗粒在电场中向着与其所带相反电荷的电极移动的现象。2、迁移率（泳动度）带电颗粒在单位电场中泳动的速度。第23页/共30页3、影响电泳速度的因素内在因素:

样品自身性质（大小、形状、电荷）外在因素:

电场（电压、电流、电阻）缓冲液（离子强度、pH值）支持介质第24页/共30页4、脂蛋白电泳的基本原理

各种脂蛋白中所含载脂蛋白的种类及数量不同，各种脂蛋白颗粒大小、带电荷的数量相差也很大，因此以琼脂糖凝胶为支持物，在电场中可使各种脂蛋白颗粒分离开来。第25页/共30页实验操作37℃水浴中染色30分钟血清：0.2ml苏丹黑染色液0.02ml摇匀1、预染血清离心（4000转／分）约5分钟第26页/共30页2、制备琼脂糖凝胶板将0.5%琼脂糖凝胶于微波炉中加热融化,

浇注到电泳槽内，静止待其凝固。3、加样:预染血清20微升

(注意:不要吸取底部的染料颗粒)4、电泳:样品放于阴极一端。接通电源，恒压电泳100V约30分钟，即可见到分离的区带。5、观察并记录电泳结果第27页/共30页♁CM前血浆脂蛋白的电泳图谱VLD