酶联免疫吸附试验的影响因素

酶联免疫吸附试验的影响因素酶联免疫吸附试验的影响因素第1页

试验过程中影响原因终止与读数结果判读试剂加样温育样本洗板显色酶联免疫吸附试验的影响因素第2页

一、标本

排泄物血清唾液尿液、粪便分泌物体液酶联免疫吸附试验的影响因素第3页血清标本脂血标本溶血标本标本保留标本离心采血试管酶联免疫吸附试验的影响因素第4页

采血试管

1.使用非抗凝标本（血清）；肝素抗凝血浆会增加OD值;EDTA、酶抑制剂(如NaN3)可抑制ELISA检测系统中辣根过氧化物酶活性;2.最好使用一次性玻璃试管或真空采血管.酶联免疫吸附试验的影响因素第5页

标本采集后，应先将标本37°放置30-60分钟后采取3000r/min离心15-20分钟，取上清液加样。15min3000r/min标本离心酶联免疫吸附试验的影响因素第6页

标本离心

强行离心分离血清，会使血清中仍残留个别纤维蛋白原，在ELISA测定过程中能够形成肉眼可见纤维蛋白块或附着在酶标板孔壁内使酶标识物不易洗掉，易造成假阳（阴）性结果。酶联免疫吸附试验的影响因素第7页

标本保留

1.一周----2～4℃保留；2.超出一周----提议-20℃保留。3.冰冻血清融解后，蛋白质会出现局部浓缩而分布不均，加样前应充分混匀。

酶联免疫吸附试验的影响因素第8页

标本保留

4.混浊或有沉淀血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。5.作屡次检测，宜少许分装冰存;6.血清标本宜在新鲜时检测尽可能防止细菌污染。酶联免疫吸附试验的影响因素第9页

防止细菌污染A.如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP会产生假阳性；

B.细菌生长，其所分泌一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用（如明胶酶等蛋白水解酶）；

C.一些细菌内源性酶如大肠杆菌β-半乳糖苷酶本身会对用对应酶作标识测定方法产生非特异性干扰。酶联免疫吸附试验的影响因素第10页

溶血标本

1.ELISA以辣根过氧化物酶标识抗原或抗体；2.红细胞破坏后可释放出大量含有过氧化物酶活性血红蛋白；3.残留过氧化物酶催化底物产生非特性显色造成结果假阳性。酶联免疫吸附试验的影响因素第11页

脂血标本

1.脂质小粒粘附在反应孔内壁；2.非离子型洗涤剂极难洗掉反应板上干扰性物质非特异性吸附，引发吸光度A值升高，易造成假阳性结果。

餐后抽血、高甘油三脂血症患者、标本离心时间、离心速度不适当等，都可使分离血清标本中残留着大量脂质小粒。酶联免疫吸附试验的影响因素第12页

二、试剂1.试剂盒保留于2-8℃2.使用前应先将检测试剂盒放置室温平衡15-30分钟，确保酶等液体初始反应温度及活性剂溶解。3.观察外包装和内组份有没有漏液。酶联免疫吸附试验的影响因素第13页三、加样仔细注意加样全部过程移液器使用及时放入孵育箱标本较多时，请分批操作试剂滴加酶联免疫吸附试验的影响因素第14页

加样过程应注意：

A.加样不可太快；B.要防止加在孔壁上部；C.不可溅出；D.防止产生气泡；E.尽可能使用同一加样器，装紧枪头，加样后充分混匀。酶联免疫吸附试验的影响因素第15页

试剂滴加

从滴瓶中滴加，应注意滴加角度和速度。滴加太快，很轻易出现重复滴加或加在两孔之间现象，这么就会在孔内非包被区出现非特异吸附，从而引发非特异显色。酶联免疫吸附试验的影响因素第16页酶联免疫吸附试验的影响因素第17页移液器使用移液方法及注意事项枪头装配量程调整酶联免疫吸附试验的影响因素第18页量程调整

1.从大致积调为小体积2.从小体积调为大致积在该过程中，千万不要将按钮旋出量程，不然会卡住内部机械装置而损坏了移液枪酶联免疫吸附试验的影响因素第19页

枪头（吸液嘴）装配

使劲地在枪头盒子上敲几下——错误

将移液枪（器）垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合——正确枪头卡紧标志是略为超出O型环，并能够看到连接个别形成清楚密封圈。酶联免疫吸附试验的影响因素第20页移液方法前进移液法反向移液法

普通用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量液体，其原理就是先吸入多于设置量程液体，转移液体时候不用吹出残余液体。重复操作移液法

适合用于快速、简便地重复转移等量同种液体。全血移液法酶联免疫吸附试验的影响因素第21页

移液注意事项

1.吸收液体时，移液器保持竖直状态，将枪头插入液面下1厘米。

注意吸液体时，一定要迟缓平稳松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入移液器内腐蚀柱塞而造成漏气。酶联免疫吸附试验的影响因素第22页

移液注意事项

2.设定加样体积，不能大于加样枪标定移液范围

3.加样吸嘴洁净和装配

4.吸收液体和排出液体动作都一定要慢。

酶联免疫吸附试验的影响因素第23页

移液注意事项

5.加样枪禁止吸收有强挥发性、强腐蚀性液体（如浓酸、浓碱、有机物等）

6.不要用大量程加样枪移取小体积液体，以免影响准确度。

酶联免疫吸附试验的影响因素第24页

移液注意事项

7.如不使用，要把移液枪量程调至最大值刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧，并将其竖直挂在移液枪架上。8.表面清洁：用10%次氯酸钠溶液或70%酒精溶液清洁后，自然晾干。

9.微量加样枪必须按要求定时进行校准。酶联免疫吸附试验的影响因素第25页四、温育

1.抗原抗体反应必须在一定温度条件下反应一定时间。2.温育所需时间与温度成反比。3.最为常见温育温度有37℃和室温，其次是43℃和2～8℃。

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实际操作中应注意：

温育温度选择足够反应时间“边缘效应”排除酶联免疫吸附试验的影响因素第27页

温育温度选择

1.微孔板从室温拿至水浴箱或温箱中时，孔内温度从室温升至37℃，需要一定时间；2.在临床试验室中，通常是将微孔板一放入温箱即开始计时，这么就很轻易造成实际测定中温育时间不够，弱阳性样本测不出来问题。酶联免疫吸附试验的影响因素第28页

“边缘效应”排除1.“边缘效应”，即外周孔显色较中心孔深;2.有研究证实在温育中热力学梯度可能是根本原因。3.聚苯乙烯本身为不良热导体，板从室（通常在25℃左右）置于37℃温箱，板升温时，在外周孔与中心孔之间可能存在一热力学梯度。酶联免疫吸附试验的影响因素第29页

总而言之，在临床ELISA测定中，要确保好测定效果，应尽可能采取水浴。

温育中让微孔板浮于水面上（浸入1/3），或将浸透水沙布放入一大饭盒中形成湿盒，然后放于温箱中，这么可使微孔板板孔底部直接与37℃水或湿布接触，而且水浴箱或湿盒内温度较高，可使反应溶液温度快速与温室平衡。酶联免疫吸附试验的影响因素第30页

五、洗板

血清中残留纤维蛋白丝或洗涤液析出结晶易使洗板机针孔全阻塞或半阻塞，造成未结合标识酶洗脱不彻底，造成“花板”造成假阳性或假阴性。酶联免疫吸附试验的影响因素第31页酶联免疫吸附试验的影响因素第32页

洗板注意事项1.要有适当浸泡时间（30-60秒）。2.洗板机吸液要彻底，残余量低于5ul。3.洗液应调至适当注出量，每孔应在350ul-450ul之间，但不要溢出孔外。酶联免疫吸附试验的影响因素第33页4.洗板次数应与说明书要求一致，尽可能不要私自增加或降低洗板次数。5.稀释洗液应使用蒸馏水或去离子水，pH值不宜过酸或过碱，确保配出洗液pH值为7.4±0.2，水质宜新鲜，长菌或有沉淀不宜使用，且用非金属容器保留。酶联免疫吸附试验的影响因素第34页6.因为洗涤液系高浓度磷酸盐，会形成结晶，配制洗液时应完全溶解。7.稀释好洗液4℃下可保留3—5天。8.洗板后，拍干包被板，应垂直扣在备好洁净吸水纸或毛巾上，且每次拍板应换掉前次拍过毛巾或吸水纸，防止交叉污染。酶联免疫吸附试验的影响因素第35页9.操作洗板机过程中要不时观察洗板

机针孔内洗液通畅情况，及时纠

正，洗板机不用时应用去离子水清

洗几遍后关机。10.每七天要进行保养清洗。酶联免疫吸附试验的影响因素第36页

六、显色

注意事项：1.检验底物溶液有效性；2.试剂显色时先加A液，后加B液，二者不要颠倒。3.前后加入间隔时间不超出10分钟。酶联免疫吸附试验的影响因素第37页4.若把A液和B液先混合，再加样显色，需要求二者等体积混合。5.A、B液应防止接触污染物。6.不一样厂家显色液不得混用。酶联免疫吸附试验的影响因素第38页

七、终止和读数

肉眼判断结果时，显色浅不易观察，影响结果准确性，必须使用酶标仪检测结果，以确保结果一致性。酶联免疫吸附试验的影响因素第39页

注意事项1、酶标仪波长是否适当或滤光片是否正确。2、单波长或双波长比色选择问题。

ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色

3、加完终止液后30分钟内读取数据。4、确保酶标板底部是清洁干燥。酶联免疫吸附试验的影响因素第40页双波长比色？

双波长比色测定能排除由微滴板本身、板孔内标本非特异吸收、指纹、刮痕、灰尘等对特异显色测定吸光度影响，普通无须设空白孔。

ELISA测定中单个空白孔非特异吸收上有一定程度不确定性；在ELISA测定比色时，最好是使用双波长比色。

酶联免疫吸附试验的影响因素第41页八、结果判读灰区定义

灰区又称灰色带反应。就是把OD值在Cutoff值正负20%这个范围内标本称为灰区标本。这个范围称为灰区。酶联免疫吸附试验的影响因素第42页

灰区处理1.灰区是客观存在，没有不存在灰区试剂，咱们只是尽可能降低灰区出现百分比。2.降低灰区最有效方法就是尽可能将板洗涤洁净。3.严格控制温育时间。酶联免疫吸附试验的影响因素第43页其它影响

1.干扰物质影响常见干扰物质如类风湿因子、

甲胎蛋白、一些本身抗体等，都会使结果造成假阳性。2.药品影响如高效价乙肝免疫球蛋白等。酶联免疫吸附试验的影响因素