基因分析技术简介专家讲座

陶慧卿基因分析技术介绍基因分析技术简介专家讲座第1页在生物、医学、农牧业领域应用基因分析技术简介专家讲座第2页测序应用基因组DNA测序cDNA测序未知序列测序已知序列再测序基因分析技术简介专家讲座第3页双脱氧链终止法原理Sanger双脱氧链终止法最大特点是引入了双脱氧核苷三磷酸（2ˊ,3ˊ-ddNTP）作为链终止剂。ddNTP能够在DNA聚合酶作用下和多核苷酸链3ˊ羟基形成磷酸二酯键，但却不能再与下一个核苷酸缩合，结果使得多核苷酸链延伸终止。基因分析技术简介专家讲座第4页双脱氧链终止法测序主要步骤扩增待测DNA片段，使其变性，取得单链DNA模板。选择一条与DNA单链互补短链引物，将引物用放射性同位素标识。引物先同单链模板复性。在四个反应管中分别加入待测DNA单链模板、互补引物分子、四种dNTP、DNA聚合酶(Klenow酶)以及不一样ddNTP进行聚合反应。基因分析技术简介专家讲座第5页基因分析技术简介专家讲座第6页双脱氧链终止法测序与PCR区分•测序只用一条引物，PCR需要两条引物•测序产物线性增加，PCR产物指数增加•测序需要dNTP和ddNTP，PCR只用dNTP•测序产物是一系列长度相差一个碱基片段，PCR产物只有一条带基因分析技术简介专家讲座第7页

1、商品化测序试剂盒-荧光染料标识

ABIPRISMBigDyev3.1和v1.1试剂盒2、自动化测序仪

ABIPRISM

310、3100和3730全自动遗传分析仪

双脱氧链终止法发展基因分析技术简介专家讲座第8页BigDyev3.1试剂盒反应体系及条件反应体系：

单链DNA模板引物DNA聚合酶Mg2+4种dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP)

4种不一样荧光标识ddNTP(ddATP,ddGTP,ddCTP和ddTTP)循环条件：

96℃1min→(96℃10s→50℃5s→60℃4min)×25个循环→4℃保温基因分析技术简介专家讲座第9页基因分析技术简介专家讲座第10页ABIPrism310GeneticAnalyzercapillarySyringewithpolymersolutionAutosamplertrayOutletbuffer+Injectionelectrode-Inletbuffer基因分析技术简介专家讲座第11页AutosamplerTraySampleVialsElectrodeCapillarySeeTechnologysectionformoreinformationonCE电进样及电泳基因分析技术简介专家讲座第12页荧光激发和检测基因分析技术简介专家讲座第13页影响测序质量原因测序成功前提：PCR本身是成功PCR产物一定要经过纯化后再测序测序引物比PCR引物靠后一些(Nestedprimers)在测序反应过程中反应体积不要有波动（蒸发）选择适当测序产物纯化方法基因分析技术简介专家讲座第14页SNP筛查单核苷酸多态(SNP)是基因组中最为丰富遗传多态，是决定个体差异最主要遗传基础。多态形式主要包含单碱基替换、插入或缺失，普通也包含微小片断插入/缺失。因为很多SNP位点本身就是功效多态位点，使得SNP在疾病易感基因相关性研究中有着广泛应用。基因分析技术简介专家讲座第15页SNaPshot™MultiplexSystem基因分析技术简介专家讲座第16页基因分析技术简介专家讲座第17页SNaPshot试剂盒反应体系及条件反应体系：

单链DNA模板引物DNA聚合酶Mg2+

4种不一样荧光标识ddNTP

循环条件：

(96℃10sec→50℃5sec→60℃30sec)×25循环→4℃保温基因分析技术简介专家讲座第18页方法特点

分型准确：该技术也称小测序技术，其准确度仅亚于直接测序。多位点同时检测：能够同时检测达12个位点，而Taqman一次仅能检测一个。不受样本量限制:而Taqman对少许样本不适合。

基因分析技术简介专家讲座第19页注意事项

1．同一反应管中，不一样位点引物长度必须不一样，最好能相差4-6个碱基。2．引物与模板互补部分（有效引物）Tm值最少要50℃。3．为了改变引物长度，区分不一样位点，能够在引物5’端加poly(dT)、poly(dA)、poly(dC)或者poly(dGACT)尾巴。这四种尾巴理论上不轻易形成二级结构，而且都经过试验验证。小心：poly(dT)有可能与真核基因3’端poly(dA)尾巴互补。4．在引物设计时候，假如+链DNA序列不理想，难以设计出最正确引物，请使用-链DNA设计引物。基因分析技术简介专家讲座第20页微卫星多态(STR)分析微卫卫星多态位点是一个短核苷酸串连重复多态（shorttandomrepeat,STR）,重复单元通常为2-5bp,因为这种重复序列在DNA复制过程中不稳定，所以突变很高，从而造成这种标识位点多态性很强，杂合度很高，正因为这种特点，微卫星多态在遗传分析中有着广泛应用.

基因分析技术简介专家讲座第21页荧光——引物荧光——PCR产物荧光激发与检测识别统计结果