基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用

基因修饰技术在人源化肝脏小鼠模型中应用基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第1页早在17世纪动物试验就已经出现了。当前试验动物广泛应用于生理学、医学、药学等学科教学与研究，以及食品、化装品、生物制品、工业产品等安全性、毒性和效力等方面试验和检测，含有主要价值和作用。试验用动物基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第2页种属差异动物基因组人类基因组代谢、免疫相关人类毒性基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第3页

肝脏是人体最主要代谢器官，也是出现受试人员中毒时最常见、表现最显著、影响最严重毒性靶器官。另据报导，每年临床发生肝毒性损伤病例亦非常多。药物引发肝损伤占全部中毒事件20%－50%，暴发性肝衰竭可达15%－30%。药品性肝损害基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第4页非阿尿苷事件回顾非阿尿苷是抗乙肝病毒核苷类似物，其前期试验药效显著，结果良好。而1993年15名受试者加大剂量（0.1or0.25mg/kg/d)）二期临床试验中，前8周疗效显著，而13周时7名受试者出现肝衰竭、脾衰竭、乳酸中毒，其中5名不治身亡。基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第5页动物试验非阿尿苷最大耐受剂量小鼠50mg/kg/d90d大鼠500mg/kg/d30d比格犬3mg/kd/d90d食蟹猴25mg/kg/d30d小鼠给药剂量到达250mg/kg/d（人类剂量1000倍）时，50只小鼠仅有4只死于肾衰竭。大鼠剂量达510mg/kg/d（人类剂量倍），连续给药70d，全部大鼠ALT、AST均正常。基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第6页毒性预测食品生物制品化妆品药物试验动物作为预测工具如不能完全准确预测人体可能会出现情况，就如同战地扫雷，一旦出现误判，代价很有可能将是巨大！危险安全基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第7页

那么能不能构建一个临床前更贴近人肝代谢、预测性更一致性试验动物模型，将可能发生人类肝毒性提前筛查出来，降低无谓成本，降低临床损失呢？这将具有极其重大意义和价值！人源化肝脏小鼠模型由此成为研究热点基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第8页分子技术生物模型临床应用当代生物医药领域研究模式

基因修饰技术ES打靶基因修饰技术TALEN基因修饰技术CRISPR/Cas9基因修饰技术TetraOneTM基因修饰技术基因修饰动物建模基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第9页免疫缺点小鼠模型构建类别序号名称基因信息特异性免疫非特异性免疫免疫

缺陷

小鼠1NudeFoxn1nu无胸腺，无T，B↓正常2SCIDPrkdcscid无T，无B正常3NOD-SCIDNOD/Prkdcscid无T，无BNK↓补体↓4Rag2Rag2-/-T、B功效缺失正常5IL2RGIl2rg-/-T、B部分功效缺失NK↓6F344RGRag2-/-/Il2rg-/-T、B功效缺失NK功效缺失7FPGPrkdc-/-/Il2rg-/-T、B功效缺失NK功效缺失8NOGNOD/Prkdcscid/Il2rgtm1Sug无T，无BNK、补体功效缺失基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第10页人源化肝脏小鼠模型构建工程基因片段uPA基因片段Fah基因片段HSVtk/GCV自杀系统Tet-on/uPA自杀系统其它移植用人类细胞肝细胞造血干细胞胸腺细胞其它基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第11页（1）uPA-Rag2小鼠（Dandri，年，德国）uPA全称尿激酶纤维蛋白溶酶原活化子（Urokinase-typePlasminogenActivator），当白蛋白开启uPA基因片段在小鼠肝细胞内表示时，纤维蛋白溶酶原会激活纤维蛋白酶，诱发粗面内质网发生裂解损伤，最终肝细胞损伤并逐步消亡。Rag2全称重组激活基因2（Recombination-ActivatingGene2），在VDJ基因重排和淋巴细胞发育中起关键性作用。Rag2-/-小鼠为C57BL/6J品系背景，T、B淋巴细胞早期发育严重停滞，外周血没有成熟循环T、B淋巴细胞，非特异性免疫收影响小。Rag2小鼠uPA基因肝细胞人源化率仅有15%，适合病毒学研究，但无法满足代谢研究需求！！基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第12页（2）uPA-SCID小鼠（Tateno，年，日本）SCID小鼠全名联合缺点免疫小鼠

（severecombinedimmunedeficiency），

其第16对染色体隐性基因突变，纯合子

淋巴细胞抗原受体基因VDJ区域重组酶活性异常，基因重排无法正常进行，影响B、T细胞正常分化，外周血白细胞总数降低，但粒细胞、巨噬细胞、NK细胞、LAK细胞正常。uPA-SCID小鼠相比uPA-Rag2小鼠含有更高人源化比率，其肝细胞替换可达50%，利用免疫抑制剂后可提升至70%，基本满足代谢和毒性研究需求，许多学者利用该模型进行了各种药品研究。SCID小鼠uPA基因基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第13页连续性自发肝损；出血性疾病造成死亡；高血补体浓度（C3）肾病；生殖障碍；移植窗较小（出生后2W内移植）；存在非特异性免疫，需药品抑制免疫。名称基因信息特异性免疫非特异性免疫肝损伤uPA-SCIDuPA/Prkdcscid无T无B正常uPA（2）uPA-SCID小鼠（Tateno，年，日本）基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第14页（3）Fah小鼠（Grompe，1993年，波兰）Fah全称延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因（fumarylacetoacetatehydrolase），Fah-/-小鼠酪氨酸代谢受阻，出现Ⅰ型酪氨酸血症，毒性产物损伤肝、肾。2-硝基-4-三氟甲苯-1,3环乙烷碘（NTBC）可以抑制酪氨酸降解通路中4-对羟基苯丙酮酸双氧化酶（4-HPPD）活性，降低毒性代谢产物积聚，起到治疗作用。NTBC治疗维持含有免疫系统，不适合人源化组织和细胞移植基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第15页Fah/nudeFah/Rag1Fah/Nod/Scidll2rg基因是白细胞介素2受体gamma链（Il-2Rγc，又称CD132)，是具有免疫功效细胞因子Il-2、Il-4、Il-7、Il-9、Il-15和I-21共同受体亚基。

L2rg-/-小鼠机体免疫功效严重降低，尤其是NK细胞活性几乎丧失。名称基因信息特异性免疫非特异性免疫肝损伤FRGFah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-T、B功效缺失NK↓Fah-/-（4）FRG小鼠（Azuma，年，波兰）基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第16页持续性自发肝脏；自发性Ⅰ型酪氨酸血症突出，易诱发肝癌；需要药品NTBC控制肝损伤程度，易对试验结果造成影响；小鼠存活率不高，喂养时易死亡。（4）FRG小鼠（Azuma，年，波兰）FRG小鼠在性状和效果上都优于Fah-/-小鼠，其肝细胞替换率达80%以上，后经其它学者改进探索，可达95%左右。该模型应用于代谢和病毒等多个领域研究，有主要意义。基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第17页名称基因信息特异性免疫非特异性免疫NOGNOD/Prkdcscid/Il2rgtm1Sug无T，无BNK、补体功效缺失（5）NOG、NSG小鼠（Ito，年，日本）NOG小鼠由日本试验动物研究所Ito培育而成。通过杂交NOD/Scid和Il2rg-/-小鼠而来，其T、B细胞皆缺失，NK细胞功效缺点。与NOD/Scid小鼠相比，NOG小鼠人体细胞和组织移植存活率显著提升，同时能够植入更高百分比正常或癌变人类细胞和组织。NOG、NSG是类似并行品系，源于日本为NOG（NOD/Shi-scid/Il-2Rγcnull），源于美国为NSG（NOD/scid/γC−/−/SzJ）。

NOG小鼠在免疫缺点模型、肿瘤模型、异种移植模型、传染病模型领域有大量应用。基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第18页名称基因改变特异性免疫非特异性免疫肝损伤TK-NOGTK/NOD/Prkdcscid/Il2rgtm1Sug无T，无BNK、补体功效缺失HSVtk/GCV系统（6）TK-NOG小鼠（Hasegawa，年，日本）单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦（HSVtk/GCV）系统是分子生物学基因修饰技术中利用十分广泛自杀系统，GCV本身无毒，不过在转染了HSVtk基因细胞中可被磷酸化，成为单磷酸盐，再经内源性细胞激酶作用可转化为二磷酸和三磷酸盐，对细胞有高毒性。♂♀♀NOGTK-NOG基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第19页含有些人肝等效酶表示及生物功效；具有较高立体组织结构；人源化程度高（≥90%）；生存率高，移植时段宽裕，可重复利用；无需外源性药物维持性状；可生殖传代（雌性可与NOG小鼠生育）；在代谢、毒性、病毒、微生物方面大量应用

-，美日有很多研究和数据。无商业化成品供给，国内起源受限！（6）TK-NOG小鼠（Hasegawa，年，日本）基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用第20页（7）uPA-NOG小鼠（Gutti，年，美国）名称基因改变特异性免疫非特异性免疫肝损伤uPA-NOGuPA/NOD/Shi-scid/Il2rgnull无T，无BNK、补体功效缺失uPAuPA-NOG小鼠是在NOG小鼠基础上经过基因修饰加入uPA基因培育而来，当前应用相对较少，有报导文件显示仅应用于病毒学研究，对肝脏人源化指数没有很高要求，仅10%左右。（8）FRGN小鼠（Wilson，