植物生理学实验专家讲座

徐芬芬植物生理学试验上饶师范学院生命科学系生物科学试验教学中心植物生理学实验第1页植物生理学试验室规则

1、认真预习试验。明确目标，掌握原理，列出步骤，提出问题。

2、认真操作，仔细观察，从实统计。

3、正确操作仪器，不乱开仪器。

4、注意安全和清洁卫生（包含值日）。

5、正确处理废物。上饶师范学院生命科学系生物试验示范中心植物生理学实验第2页试验汇报要求试验原理：简明扼要；材料：用什么？方法：实际操作过程；数据计算：原始数据，计算公式，结果。讨论和分析：针对自己结果进行。试验汇报在下一次试验时上交，但试验原始数据须经指导老师审核后才可离开。上饶师范学院生命科学系生物科学试验教学中心植物生理学实验第3页植物生理学试验评分标准课上：1、预习汇报2、认真试验，操作规范，试验结果符合要求3、不迟到，不早退，主动参加卫生清扫上饶师范学院生命科学系生物科学试验教学中心植物生理学实验第4页课下：试验汇报评分标准1、卷面清洁，字迹工整10分2、语句通畅，简明扼要，逻辑性强，表示准确无概念错误20分3、预习汇报、试验原始统计、试验汇报齐全15分4、试验汇报格式规范，重点突出15分5、试验原始统计要如实认真统计实际操作、察及测定结果20分6、对试验结果讨论要充分有据，论点要正确，与该试验无关内容不要写入汇报中20分7、剽窃他人汇报者0分生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第5页本学期试验内容与安排

1、质壁分离法测定植物组织渗透势

2、植物体内硝态氮含量测定3、叶绿素a、b含量测定

4、赤霉素对水稻α-淀粉酶诱导形成5、植物呼吸强度测定

6、

种子活力快速测定—氯化三苯基四氮唑(TTC)法及红墨水法7、丙二醛含量测定生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第6页试验一

质壁分离法测定植物组织渗透势

生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第7页一、试验目标、原理[试验目标]观察植物组织在不一样浓度溶液中细胞质壁分离产生过程及其用于测定植物组织渗透势测定[试验原理]原生质层（细胞膜、原生质、液泡膜）含有选择透过性，近似于半透膜，一个成熟植物细胞就是一个完整渗透装置：当外界溶液浓度大于细胞液浓度时(高渗溶液），细胞失水，发生质壁分离；当外界溶液浓度小于细胞液浓度时（低渗溶液），细胞吸水；当植物组织细胞内汁液与其周围某种溶液处于渗透平衡状态，当外界溶液浓度等于细胞液浓度时（等渗溶液），植物细胞内压力势为零时，细胞汁液渗透势就等于该溶液渗透势。细胞水势等于细胞液渗透势等于外界溶液渗透势。生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第8页

质壁分离及质壁分离复原将植物组织置于对其无毒害一系列不一样浓度溶液里处理一定时间，然后镜检发生质壁分离情况，细胞等渗浓度将界于刚才引发初始质壁分离浓度和不能引发质壁分离浓度之间。代入公式即可计算渗透势。生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第9页二、材料、器材与试剂1试验材料洋葱表皮2试验仪器显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，刀片，培养皿，记号笔，滴管。3试验试剂分别配制0.50、0.45、0.4、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10mol/L蔗糖溶液，贮9个试剂瓶中。称34.23g蔗糖用蒸馏水配成100ml，其浓度为1mol/L(母液)。再配制成以下各种浓度：0.50mol/L：吸母液25ml+水25ml0.45mol/L：吸母液22.5ml+水27.5ml0.40mol/L：吸母液20.0ml+水30.0ml0.35mol/L：吸母液17.5ml+水32.5ml0.30mol/L：吸母液15.0ml+水35.0ml0.25mol/L：吸母液12.5ml+水37.5ml

0.20mol/L：吸母液10.0ml+水40.0ml

0.15mol/L：吸母液7.5ml+水42.5ml

0.10mol/L：吸母液5.0ml+水45.0ml生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第10页三、实验步骤1.取6套洁净清洁小培养皿，用记号笔编号，将配制好不一样浓度蔗糖溶液按次序倒入各个培养皿中使成一薄层，盖好皿盖。2.选取有色素洋葱鳞片外表皮快速分别投入各种浓度蔗糖溶液中，每个培养皿中放材料3个左右，使其完全浸没，浸泡20分钟左右。3.到时后，取出表皮，放在载玻片上，滴一滴相同浓度蔗糖，盖上盖玻片，在显微镜下观察质壁分离细胞数假如全部细胞都产生质壁分离现象，则取低浓度溶液中制片做一样观察，并统计质壁分离相对程度。上饶师范学院生命科学系生物科学试验教学中心植物生理学实验第11页4.在试验中确定一个引发半数以上细胞原生质刚才从细胞壁角隅上分离最低浓度，和不引发质壁分离最高浓度。5.在找到上述浓度极限时，用新溶液和新鲜叶片重复进行几次，直到有把握为止。在此条件下，细胞渗透势与两个极限溶液浓度之平均值渗透势相等。生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第12页6．计算求得C1按下式计算渗透势按ψπ=-iRTC1计算水势值。C＝等渗溶液质量摩尔浓度，单位是mol/kg；R＝气体常数（0.008314MPa/L/mol/K）T＝绝对温度i＝解离系数（蔗糖＝1，CaCl2＝2.60）生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第13页【思索题】

用质壁分离法测定植物细胞渗透势与用小液流法测定植物组织水势都是以外液浓度算出溶质势为依据，他们之间区分何在。生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第14页试验二

植物体内硝态氮含量测定生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第15页一、试验目标、原理[试验目标]硝态氮是植物最主要氮源。植物体内硝态氮含量往往能反应土壤中硝态氮供给情况，所以可作为土壤肥氮肥指标。测定植物体内硝态氮含量，不但能够反应出植物氮素营养情况，而且对判定蔬菜和植物为原料加工制品品质也有主要意义。[试验原理]

在浓酸条件下，NO3-与水杨酸反应，生成硝基水杨酸，硝基水杨酸在碱性条件下（PH>12）呈黄色，在一定范围内，其颜色深浅与含量成正比，可直接比色测定。

上饶师范学院生命科学系生物科学试验教学中心植物生理学实验第16页二、材料、设备仪器及试剂（一）材料白菜叶片（二）仪器设备及试剂1试验仪器722型分光光度计、电子天平。

2试验试剂（1）

500ppmNO3-标准溶液准确称取烘至恒重KNO30.7221克溶于无离水中，定容至200ml。

（2）

5%水杨酸一硫酸溶液称取5克水杨酸溶于100ml，浓硫酸中（密度为1.84），搅拌溶解后，贮于棕色瓶中。置冰箱保留一周有效。

（3）8%氢氧化纳溶液称取10克氢氧化纳溶于1升无离子水中即可。

生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第17页三、试验步骤1.标准曲线制作

（1）吸收500ppmNO3-标准溶液1ml.2ml.3ml.4ml.6ml.8ml.10ml.12ml分别放入501ml容量瓶中，用无离子定至刻度，使之成10、20、30、40、60、80、100、120ppm系列标准溶液。

（2）吸收上述系列标准溶液0.11ml，分别放入刻度试管中，以0.11ml无离子水代替标准溶液作空白，再分别加入0.4ml水杨酸一硫酸溶液，摇匀，在室温下放置20分钟后再加入8%NaOH溶液9.51ml摇匀冷却至室温，显色液总体积为101ml。

（3）以空白作参比，在410nm波长下测定吸光度。以NO3-N浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。上饶师范学院生命科学系生物科学试验教学中心植物生理学实验第18页三、试验步骤

2.样品中硝酸盐测定

（1）样品液制备，取一定量植物材料剪碎混匀后，准确称取2-3克分别放入三支刻度试管中，加入10ml无离子水，用玻璃塞封口，置入沸水浴中提取30分钟，到时间后取出，用自来水冷却，将是取液过滤到25ml容量瓶中，并重复冲洗残渣，最定容至刻度。

（2）样口液测定吸收样品0.1ml分别于三支刻度试管中，然后加入5%水杨酸一硫酸溶液0.4ml，混匀后置室温下20分钟，再慢慢加入9.5ml8%NaOH溶液，待冷却至室温后，以空白作参比，在410nm波长下测期吸光度。在标准曲线上查得或用回归方程计算出NO3--N浓度，再用下公式计算其含量。

生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第19页

四、结果计算四氮唑还原强度：根重（g）×时间(h)mg/g(根鲜重)/h=四氮唑还原量（mg）生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第20页试验三

叶绿素a、b含量测定生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第21页一、试验目标、原理[试验目标]

在未经分离叶绿体色素溶液中测定叶绿素a和b方法及其计算。[试验原理]假如混合液中两个组分，它们光谱吸收峰即使有显著差异，但吸收曲线彼此有重合，在这种情况下要分别测定两个组分，可依据朗伯-比尔（Lambert-Beer）定律，经过代数方法，计算一个组分因为另一个组分存在时对光密度影响，最终分别得到两种组分含量。依据叶绿素a和b吸收光谱曲线，叶绿素a最大吸收峰在663nm，叶绿素b最大吸收峰在645nm,吸收曲线彼此又有重合。生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第22页生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第23页生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第24页依据朗伯-比尔定律，最大吸收光谱峰不一样两个组分混合液，它们浓度C与光密度OD之间有以下关系：OD1=Ca·ka1+Cb·kb1(1)OD2=Ca·ka2+Cb·kb2(2)式中，ka1、ka2、kb1、kb2分别为组分a、b在浓度1g/L时，对应波长为λ1、λ2时光密度OD值，即比吸收系数。波长/nm叶绿素a叶绿素b66382.049.2764516.7545.60将表中数值代入（1）、（2）式，并解方程可得：Ca=0.00127OD663-0.00269OD645(3)Cb=0.0229OD645-0.00468OD663(4)将单位改为mg/L，于是总叶绿素浓度为CT=Ca+Cb=8.02OD663+20.21OD645(5)生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第25页1试验仪器高级型分光光度计，离心机，天平，剪刀，研钵，漏斗，移液管等。2试验试剂丙酮，碳酸钙，石英砂。3试验材料大叶黄杨叶片。二、试验材料、仪器与设备生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第26页称取新鲜叶片0.5g→加纯丙酮5ml研磨成匀浆→再加80%丙酮5ml，并转入离心管→充分洗涤研钵→离心→定容至20ml→取上述提取液1ml，加80%丙酮4ml稀释后转入比色杯中，以80%丙酮为对照，测定光密度→计算各种浓度（Ca、Cb）。三、试验步骤生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第27页四、试验结果计算将测定得到吸光值代入下面式子：Ca=13.95A665－6.88A649Cb=24.96A649－7.32A665Cr=18.08A649+6.63A665

（Ca、Cb：mg/L）叶绿素含量（mg/g）=[叶绿素浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第28页1因为植物叶子中含有水分，故先用纯丙酮进行提取，以使色素提取液中丙酮最终浓度近似80%。2因为叶绿素a、叶绿素b吸收峰很陡，仪器波长稍有偏差，就会使结果产生很大误差。五、注意事项生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第29页六、试验作业1、为何提取色素时先用纯丙酮提取，再用80%丙酮提取？2、依据你试验结果计算出该种植物叶绿素a、b比值。3、依据你试验结果，计算出该植物每克鲜重叶片中叶绿素含量（单位用mg·g-1FW表示）生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第30页试验四

赤霉素对水稻α-淀粉酶诱导形成生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第31页一、试验目标、原理[试验目标]1．经过试验深入了解赤霉素在种子萌发过程中调控作用。2．掌握测定α-淀粉酶活一个简便方法[试验原理]淀粉性种子在萌动过程中，胚释放出来赤霉素能诱导糊粉层细胞中α-淀粉酶基因表示，引发α-淀粉酶生物合成，并分泌到胚乳中催化淀粉水解为糖。外源赤霉素能代替胚分泌作用，诱导α-淀粉酶形成。β-淀粉酶也能将淀粉水解成还原糖，但β-淀粉酶不耐热，在高温下易钝化。将酶液在高温下维持一段时间，钝化β-淀粉酶，可准确测定α-淀粉酶活性。生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第32页二、试验材料、仪器、试剂1试验材料：水稻种子

2试验仪器设备：分光光度计、恒温箱、

水浴锅、

移液管、

烧杯、

试管、青霉素小瓶、镊子、刀片。

3试验试剂：2mol/LNaOH溶液、1%淀粉溶液、20mg/L赤霉素溶液、0.1mol/L(PH5.6)柠檬酸缓冲液、2，3，5-二硝基水杨酸（DNS）试剂生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第33页三、试验步骤1.水稻种子选择和预处理选取大小一致、健康水稻种子，一份放入盛有适量20mg/LGA溶液中，另一份放入盛有适量清水培养皿中处理24h,取出后用清水冲洗，置于培养箱中再陪养1d，处理与培养温度均为30℃。2.酶提取取对照和GA3处理培养种子2g→磨成匀浆→到入50ml容量瓶中→用蒸馏水定容至刻度→混匀→放置15-20min（每2min震荡一次）→离心（4000r/min,15min）生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第34页3.α-淀粉酶活性测定取试管4只→编号（清水试验；清水调零；GA3试验；GA3调零）→每管中各加入酶液1ml→70℃恒温水浴加热12min→各加入1ml柠檬酸缓冲液→①将试验管置于40℃恒温水浴15min→再快速加入预热淀粉溶液2ml→40℃恒温水浴5min→加入NaOH溶液0.5ml终止反应；②调零管中加入2mol/LNaOH溶液0.5ml→混匀→加入预热淀粉溶液2ml.4.样品测定取以上各管中溶液1ml于15ml刻度试管中→加入DNS试剂1ml→混匀→沸水煮沸5min→快速冷却→定容至12ml→520nm波长测定OD值。生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第35页四、结果计算

α-淀粉酶活性=（OD520×稀释倍数）/样品鲜重/反应时间生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第36页试验五

植物呼吸强度测定生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第37页一、原理利用NaOH溶液滴定呼吸过程中释放CO2，试验结束后，用草酸溶液滴定残留NaOH，从空白和样品二者消耗草酸溶液之差，即可计算出呼吸过程中释放CO2量。C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O2NaOH+CO2→Na2CO3+H2O2NaOH+C2H2O4(草酸)→Na2C2O4(草酸钠)+2H2O生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第38页二、材料、仪器设备及试剂1.试验仪器锥形瓶，秒表，酸式滴定管，移液管，尼龙网袋2个。2.试验试剂1/44mol/L草酸溶液，0.2MNaOH溶液，1%酚酞。3.试验材料萌发水稻种子（48h）。生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第39页三、试验步骤

1.称取萌发水稻种子10g，装入尼龙小袋内，把小袋系到锥形瓶塞小钩上。2.用移液管吸收20mlNaOH加入锥形瓶中，塞紧瓶塞并马上计时。3.试验进行30分钟，其间每隔数分钟轻轻摇瓶内碱液数次。4.打开锥形瓶塞，滴入酚酞2滴，马上用草酸滴定，滴定至红色突然消失，记下滴定样品消耗草酸※用量。5.另称取萌发水稻种子10g，用沸水煮5-10分钟，作一样测定，以此为对照。生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第40页四、试验结果用对照煮过种子消耗草酸量v0ml减去萌发样品消耗草酸量v1ml，按每秒消耗1ml草酸相当于1mgCO2来计算种子在呼吸时放出CO2mg数。呼吸强度（mgCO2•g-1FW•s-1）=1mgCO2•(v0-v1)•W-1•t-1式中，W为样品质量（克），t为呼吸连续时间（秒）生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第41页五、试验作业1.影响呼吸强度原因有哪些？2.为何用草酸滴定而不用盐酸或硫酸滴定？3.依据你试验结果，计算出水稻种子呼吸强度（单位用mgCO2·g-1FW·h-1表示）生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第42页试验六

种子活力快速测定

氯化三苯基四氮唑(TTC)法及红墨水法生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第43页一、试验目标、原理[试验目标]

熟悉氯化三苯基四氮唑(TTC)法及红墨水法测定种子活力方法及其计算。【试验原理】凡有生活力种胚在呼吸作用过程中都有氧化还原反应，而无生活力种胚则无此反应。当TTC溶液渗透种胚活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶(NADH2或NADPH2)还原时，可产生红色三苯基甲(TTＦ)，胚便染成红色。当种胚生活力下降时，呼吸作用显著减弱，脱氢酶活性亦大大下降，胚颜色改变不显著，故可由染色程度推知种子生活力强弱。生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第44页二、材料、仪器设备及试剂1仪器培养皿2套；镊子1把；单面刀片1片；垫板(切种子用)1块；烧杯1个；棕色试剂瓶；解剖针1把；搪瓷盘1个；PH试纸。2试剂TTC溶液配制：取3gTTC溶于1L蒸馏水或冷开水中，配制成0.1％TTC溶液。药液PH应在6.5～7.5，以PH试纸试之(如不易溶解，可先加少许酒精，使其溶解后再加水)。生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第45页三、试验步骤1将水稻新种子、陈种子或死种子，用温水(30℃)浸泡2～6H，使种子充分吸胀。2随机取种子2份，每份200粒，沿种胚中央准确切开，取每粒种子二分之一备用。3把切好种子分别放在培养皿中，加TTC溶液，以浸没种子为度。4放入30～35℃恒温箱内保温30Min。也可在20℃左右室温下放置40～60Min。5保温后，倾出药液，用自来水冲洗2～3次，马上观察种胚着色情况，判断种子有没有生活力。生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第46页四、注意事项1．TTC溶液最好现用现配，如需贮藏则应贮于棕色瓶中，放在阴凉黑暗处，如溶液变红则不可再用。2．染色温度普通以25～35℃为宜。3．判断有生活力种子应具备特征：胚发育良好、完整、整个胚染成鲜红色；子叶允许有小部分坏死，但其部位不是胚中轴和子叶连接处；胚根尖虽有小部分坏死，但其它部位完好。4．判断无生活力种子应具备特征：胚全部或大部分不染色；胚根不染色部分不限于根尖；子叶不染色或丧失机能组织超出1／2；胚染成很淡紫红色或淡灰红色；子叶与胚中轴连接处或在胚根上有坏死部分；胚根受伤以及发育不良未成熟种子。5．对于不一样作物种子生活力测定，所需试剂浓度、浸泡时间、染色时间不一样。生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第47页红墨水染色法【试验原理】有生活力种子其胚细胞原生质含有半透性，含有选择吸收外界物质能力，一些染料如红墨水中酸性大红G不能进入细胞内，胚部不染色。而丧失活力种子其胚部细胞原生质膜丧失了选择吸收能力，染料进入细胞内使胚部染色，所以可依据种子胚部是否染色来判断种子生活力。生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第48页仪器与试剂仪器与TTC法相同试剂红墨水溶液配制：取市售红墨水稀释20倍(1份红墨水加19份自来水)作为染色剂。生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第49页试验步骤1.先将待测种子用水浸泡3～4H，待充分吸胀后取出一部分种子，在沸水中煮沸3～5Min，作为死种子。2.取浸好新种子、陈种子和死种子各50粒，如为小麦和玉米，则用单面刀片沿胚部中线纵切成两半，其中二分之一用于测定。3.将准备好种子分别放在培养皿内，加入红墨水溶液，以浸没种子为度。生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第50页4.染色10～20Min后倾出溶液，用自来水重复冲洗种子，直到所染颜色不再洗出为止。5.对比观察冲洗后新种子、陈种子和死种子胚部着色情况。凡胚部不着色或略带浅红色者，即含有生活力种子，若胚部染成与胚乳相同红色，则为死种子。生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第51页思索题TTC法和红墨水测定种子生活力有何不一样？生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第52页试验七

丙二醛含量测定生命科学系生物科学试验教学中心上饶师范学院植物生理学实验第53页一、试验目标、原理[试验目标]熟悉叶片中丙二醛（MDA）测定方法及其计算。[试验原理]植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化作用最终分解产物，其含量能够反应植物遭受逆境伤害程度。丙二醛在酸性和高温条件，能够与硫代巴比妥酸（TBA）反应生成红棕色三甲川（3,5,5—三甲基恶唑2,4-二酮），在532nm处有最大光吸收，在600nm处有最小光吸收，该复合物吸光