代谢组学的研究方法和研究流程

代谢组学研究方法和究流程分子微生物学112300003

林兵随着人类基因组计划等重大科学项目的实,基组学、转录组学及蛋白质组学在研究人类生命科学的过程中发挥了重要的作,与此同时,代谢组（metabolomics20世纪90年中期产生并迅速地发展起,基因组学录组学白组学共同组成系统生物学。基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等各种组在命科学领域中发挥了重要的作用,它们分别从调控生命程的不同层面进行研究,使人们能够从分子水平研究生命现象探生命的本质逐步统地认识生命发展的规律组手段加上生物信息学,成为系统生物学的重要组成部分。代谢组学的出现和发展是必要,同时也是必须的基因组学和蛋白质组学在生命科学研究中的缺点和不足,代谢组学正好可以进行弥补组学研究的是生命个体对外源性物质药或毒物的激变化或遗传修饰所做出的所有代谢应,并检测这种应答的全貌及其动态变化组方法为生命科学的发展提供了有力的现代化实验技术手,同时也为新药临床前安全性评价与实践提供了新的技术支持与保障。1

代谢组学概念及发展代谢组学最初是由英国帝国理工大JeremyN教提出,他为代谢组学是将人体作为一个完整的系统,机体的生理病理过程作为一个动态的系统来研究,并且将代谢组学定义为生物体对病理生理或基因修饰等刺激产生的代谢物质动态应答的定量测定。2000年德国马普所的iehn等出了代谢组学的概,但是Nicholson提出的代谢组学不同,他将代谢组学定位为一静态的过,也可以称为代谢物组,即限定条件下的特定生物样品中所有代谢产物的定性定量分析。同F还将代谢组学按照研究目的的不同分为类代谢物靶标分,代谢轮(谱分析代谢学代指纹分析。现在代谢组学在国内外的研究都在迅速地发展,科家们对代谢组学这一概念也进行了完善作出了科学的定义:代组学是对一生物系统的细胞在给定时间和条件下所有小分子代谢物质的定性定量分析,从定量描生物内源性代谢物质的整体及其对内因和外因变化应答规律的科学。与基因组学转录组学蛋质学相,代谢组学的主要研究思想是全局观点与传统的代谢研究相,代谢学融合了物理学学分析化学等多学科知,利现代化的先进的仪器联用分析技术对机体在特定的条件下整个代谢产物谱的变化进行检测,并通过特殊的多元统计分析方法研究整体的生物学功能状况代谢组学的研究对象是人体或动物体的所有代谢产,而些谢产物的产生都是由机体的内源性物质发生反应生成,因此,代谢物的变化也就揭示了内源性物质或是基因水平的变化,这研究对象从微观的基因变为宏观的代谢物,宏代谢表型的研究使得科学研究的对象范围缩小而且更加直观易理,这也是代谢组研究的优势之一。代谢组学的优势主要包括:对体损伤小所得到的信息量大,相于基因组学和蛋白质组学检测更加容易代组学发展的时间较,且由于代谢组学的分析对象是无偏向性的样品中所有的小分子物质,因此对分析手段的要求比较高,在数据处理和模式识别上也不成,存在些不足之处生物体代谢物组变化,稳性较难控制当机体的生理和药理效应超敏时,受物即使没有相关毒性,也能引起明显的代谢变化,导致假阳性结果。

代谢组学应用领域大致可以分为以7方面(植功能基因组研究主要拟南芥为研究模,也包括一些转基因作物的研究。(2)疾病断根据代谢物特图谱诊断肿瘤、糖尿病等疾病。(制业即新药临床前安全性评主要通过高通量比对预测药物的毒性和有效,通过全面分析来发现新的生物指示剂。(微物领域。(毒学研究包利用代谢组学平台研究环境毒理及药物毒理。(食及营养学,即究食品进入体内的营养成分及其与体内代谢物的相互作用。(7在中药现代化及其机理上研究。2

代谢组学研究方法代谢组学的研究过程一般包括代谢组数据的采集据处理多量数据分析标记物识别和途径分析等步骤,集生物样(如尿液织胞和培养液)对其进行生物反应灭活预处理再运用先进的分析手段如核磁共振谱或色谱等检测样品中所有代谢物的种类、含量、状,从而得到原始的大量的反映生物样品信息的实验数,而后使用多变量数据分析方法对获得的多维复杂数据进行降维和信息挖掘,从些复杂大量的信息中筛选出最主要的最能反映代谢物变化的主要成分,再过模式识别将其与标准的代谢物谱进行比对,或根据代谢物谱在时程上的变化来寻找生物标记物,研相关代谢物变化涉及的代谢途径和变化规,阐述生物体对相应刺激的响应机制由不同分析手段各有其特点在同应用领域使用的分析方法也是有所不同的。核核磁共(nuclearmagneticresonance,NMR机结构测定的四大谱学之,作一种分析物质的手段由其可深入物质内部而不破坏样,并具有迅速确辨率高等优点而得以迅速发展和广泛应用代谢组学发展的早期NMR技术被广泛应用在毒性代谢组学的研究中NMR的优在能够对样品实现无创性偏向的检,具有好的客观性和重现性样不需要烦琐处,具有较高的通量和较低的单位样品检测成本。此,-NMR对氢化合物均有响应,能成样品中大多数化合物的检测,满代谢组学中的对尽可能多的化合物进行检测的目标。NMR虽然可对复杂样品如尿液、液等进行非破坏性分,与质谱法相比它的点是检测灵敏度相对较低采现有成熟的超低温探头技,其测灵敏度在纳克级水平)态范围有限很同时测定生物体中共存的浓度相差较大的代谢产;同时购置器所需的投资也较大。为了改进检灵敏度较低的缺,可采高分辨核磁共振技术或使用多维核磁共振技术和液相色-核共振联(魔旋转magicanglespinning,MAS)核磁共振技术是0世纪0年初发展起来的一种新型的核磁共振技,在代谢组学的研究中魔旋转核磁共振波谱技术已被成功地应用到研究生物组织,因为生物组织在核磁共振实验中会由于磁化率不均匀子动受限等因素而引起谱线增宽些素利用固体核磁共振中的AS方法可以消除。如大鼠肝脏、哺乳动物肾脏以及大鼠睾丸组织等。质GC是代谢组学常用的方法先主要应用于植物组学研究着}工程和分析技术的快速发展其微生物代谢学的应用越来越引起关注—MS的分离效率高易于使用且较为经济是用标准电子轰(EI)式后用范围和重复性都进一步提高。但是GC—MS需要对挥发性较低的谢物进行衍生化预处理一步骤会耗费额外的时间

至引起样品的变化限—MS无法分析热不稳定性的物质和分子量较大的代谢产物。近来，多维分离技术如二级气相色谱飞行时间质(GC—GC—TOF—MS)，检测范围更广，但由于实际应用困难和花费较高等问题使其并未普遍使用。篇关于微生物代谢组学的文献报道了应用种同GC—MS术，分析肠系膜明串珠菌发酵生产葡聚糖过程中脂肪酸、氨基酸和糖类以监测微生物污染。LC—MS无需进行样品的衍生化处，检测范围广，可以作的充，非常适合于生物样本中低挥发性或非挥发性、热稳定性差的代谢物LC与电喷雾(质连用可以分析大部分极性代谢物，此外，离子配(IP)LC—MS、亲水相互作用液相色谱HILIC—MS、反相C—MSI等可以进行不同种类谢物的及时定量分析Brerau等利用HILIC—MS获得了大肠杆菌和酿酒酵母饥饿胁迫应答的代谢指纹图谱，测68胞内代谢物的浓度发生了改变。LC—ESI—MS—MS分析被用于测量葡萄糖冲击下的酿酒酵母的糖分解和三羧酸循环中间代谢产物。CE—MS分离样品效率比普通的色质谱联用要高得多需极少的进液量(nL)而且其测试时问短试成本低在生物代谢组领域发挥着越来越重要的作用Ohashi等221通过CE—TOF—MS大肠杆菌的阴离子和阳离子代谢产物进行了全面分析和定量，鉴别出主要代谢物中的75个亲水中问体其中198个代谢物进行了定量等运用反相电渗流EOF)CE高效分离了辅A、有机酸、核苷酸和磷酸糖Soga等用E—MS系统研究了枯草杆菌在芽孢发生过程中的代谢谱的变化过程别1692种谢物鉴别出其中的50种。3

代谢组学研究流程代谢组学研究的技术平台一般流程包括样品制备谢物的检测和分析鉴定数分析与模型建立。下图为代谢组学的流程图自动进样数据分析与样品的提取

样品预处理

化合物的分离

检测及鉴定

可视化，建模与仿真1

微生物代谢物样品的制备一般分为微生物培养和代谢产物的提取研对象、目的和采用的分析技术不同需的样品提取和预处理方法各异存一种普适性的标准化方法。在样品淬灭和代谢物的提取过程中，应遵循的原则是：(1)灭工艺最好可以立即冻结细胞代谢(2)在淬灭过程中要细胞膜无明显损伤免胞内代谢物外泄提取过程中应该尽可能多的提取胞内代物谢产物不应该遇到任何物理或化学修饰得的样品基质应与所选择的分析方法相容甲醇和液氮是最常用的淬灭方法在取方面由于特定的提取条件往往仅适合某些类化合物，目前尚无一种能够适合所有代谢产物的提取方法。应该根据不同的化合物选择不同的提取方法，并对提取条件进行优化。

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生命科学领域的巨大进步与先进分析技术密不可分，进行代谢组学研究首要解决的是分析方法上的理论和技术问题的酶法定量胞内外代谢物只能分析一个样品中的一个或几个代谢物，且需要的样品体积大胞内代谢物’浓度一般很低，在淬灭或提取过程中又会被稀释所的样品体积一般少些都将严重影响酶法定量的可靠性谢学定量胞内外代谢物的分析方法要求具有高灵敏度通量和无偏向性的特点分复杂的胞内外产物时所用的分析方法是分重要的般根据样品的特性和试验目的选择最合适的分析方法。目前最常用的分离分析手段是气相色谱与质谱联用GC—MS)、液相色谱与质谱联用（—MS)、毛细管电泳质谱联(CE—MS)及核磁共振NMR)。3

在代谢组学研究中，大多数是从检测到的代谢产物信息中进行两(如基因突变前后的响应)或多类如同表型问代谢产物判分类以及生物标记物的发现于物样品的组成复杂在到分析对象的原谱图后先需要对数据进行预处(归一化和滤噪除干扰因素留用信息据解析可分为如下3个本步骤提出色谱分（如GC—M