微生物的生长与环境条件

第六章微生物生长和环境条件

微生物的生长与环境条件第1页第一节、微生物群体生长一、获纯培养方法1、纯培养定义：从一个细胞繁殖所得到后代细胞群体称为纯培养。2、取得纯培养方法：（1）稀释---液体培养法（2）单细胞挑取法（3）平板培养分离法微生物的生长与环境条件第2页微生物的生长与环境条件第3页（3）平板培养分离法：A、平板划线分离法B、涂布平板法C、倾注（混合）平板法划线分离法步骤：划线挑菌灼烧划线灼烧划线微生物的生长与环境条件第4页微生物的生长与环境条件第5页二、细菌群体数量测量1、显微直接计数法微生物的生长与环境条件第6页优点：快速、方便缺点：不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌计数；（甲醛或适度加热（不能把计数板加热））需要相对高细菌浓度；（107cell/ml）个体小细菌在显微镜下难以观察；微生物的生长与环境条件第7页2、比浊法在一定波长下，测定菌悬液光密度，以光密度(opticaldensity,即O.D.)表示菌量。波长普通选定在450~650nm微生物的生长与环境条件第8页培养基颜色颗粒杂质试验测量时应控制在菌浓度与光密度成正比线性范围内，不然不准确。普通OD在1.0以下时和微生物数量呈正比微生物的生长与环境条件第9页3、稀释平板法（1）倾注平板法(混合平板法)（2）涂布平板法菌落计数稀释到适量浓度倾注或涂布平板培养微生物的生长与环境条件第10页微生物的生长与环境条件第11页混合平板和涂布平板区分微生物的生长与环境条件第12页普通用菌落形成单位（colonyformingunits，CFU）来表示原样品中细胞数。微生物的生长与环境条件第13页4、膜过滤培养法当样品中菌数很低时，能够将一定体积湖水、海水或饮用水等样品经过膜过滤器，然后将将膜转到对应培养基上进行培养，对形成菌落进行统计。微生物的生长与环境条件第14页微生物的生长与环境条件第15页主要适合用于只能进行液体培养微生物，或采取液体判别培养基进行直接判定并计数微生物。5、MPN法：mostprobablenumber对未知样品进行十倍稀释，然后依据估算取三个连续稀释度平行接种多支试管，对这些平行试管微生物生长情况进行统计，长菌为阳性，未长菌为阴性，然后依据数学统计计算出样品中微生物数目。微生物的生长与环境条件第16页微生物的生长与环境条件第17页三、分批生长中细菌群体生长微生物的生长与环境条件第18页(一)生长曲线生长曲线(GrowthCurve)：细菌接种到定量液体培养基中，定时取样测定细胞数量，以培养时间为横座标，以菌数为纵座标作图，得到一条反应细菌在整个培养期间菌数改变规律曲线。微生物的生长与环境条件第19页细菌生长曲线普通用菌数对数为纵坐标作图微生物的生长与环境条件第20页一条经典生长曲线最少能够分为

延滞期，对数期，稳定时和衰亡期四个生长时期微生物的生长与环境条件第21页延滞期(Lagphase)：将少许菌种接入新鲜培养基后，在开始一段时间内菌数不马上增加，或增加极少，生长速度靠近于零。延滞期特点：分裂迟缓、代谢活跃细胞形态变大或增加，比如巨大芽孢杆菌，在迟缓期末，细胞平均长度比刚接种时长6倍。普通来说处于迟缓期细菌细胞体积最大细胞内RNA尤其是rRNA含量增高，合成代谢活跃，核糖体、酶类和ATP合成加紧，易产生诱导酶。对外界不良条件反应敏感。微生物的生长与环境条件第22页微生物的生长与环境条件第23页迟缓期出现原因：微生物接种到一个新环境，暂时缺乏分解和催化相关底物酶，或是缺乏充分中间代谢产物等。为产生诱导酶或合成中间代谢产物，就需要一段适应期。在生产实践中缩短迟缓期惯用伎俩：(1)利用对数生长久细胞作为种子；(2)尽可能使接种前后所使用培养基组成不要相差太大；(3)适当扩大接种量微生物的生长与环境条件第24页对数生长久(Logphase)：又称指数生长久(Exponentialphase)以最大速率生长和分裂，细菌数量呈对数增加，细菌内各成份按百分比有规律地增加，表现为平衡生长。对数生长久细菌个体形态、化学组成和生理特征等均较一致，代谢旺盛、生长快速、代时稳定。微生物的生长与环境条件第25页在细菌个体生长里，每个细菌分裂繁殖一代所需时间为代时(Generationtime)，在群体生长里细菌数量增加一倍所需时间称为倍增时间（Doublingtime)。代时通常以G表示。微生物的生长与环境条件第26页稳定生长久(Stationaryphase)：因为营养物质消耗，代谢产物积累和pH等环境改变，逐步不宜于细菌生长，造成生长速率降低直至零(即细菌分裂增加数量等于细菌死亡数)。稳定生长久又称恒定时或最高生长久，此时培养液中活细菌数最高并维持稳定。生长得率:每摩尔底物产生菌体干重微生物的生长与环境条件第27页衰亡期(Decline或Deathphase)：营养物质耗尽和有毒代谢产物大量积累，细菌死亡速率超出新生速率，整个群体展现出负增加。微生物的生长与环境条件第28页同时培养(Synchronousculture)：使群体中细胞处于比较一致，生长发育均处于同一阶段上，即大多数细胞能同时进行生长或分裂培养方法。(二)同时培养同时培养物常被用来研究在单个细胞上难以研究生理与遗传特征，它是一个理想材料。微生物的生长与环境条件第29页机械方法离心方法过滤分离法硝酸纤维素滤膜洗脱法环境条件诱导温度培养基成份控制其它（如光照和黑暗交替培养）微生物的生长与环境条件第30页密度梯度离心法取得同时细胞基本步骤分部搜集各层细胞细胞分层离心后不一样时群体细菌10%蔗糖↓30%梯度利用各部细胞接种微生物的生长与环境条件第31页硝酸纤维素滤膜法是最经典取得同时生长方法因为细胞个体差异，同时生长往往只能维持2-3个世代，随即又逐步转变为随机生长。微生物的生长与环境条件第32页连续培养(Continousculture）在微生物整个培养期间，经过一定方式使微生物能以恒定比生长速率生长并能连续生长下去一个培养方法。四、细菌群体生长连续培养微生物的生长与环境条件第33页控制连续培养方法恒浊连续培养不停调整流速而使细菌培养液浊度保持恒定恒化连续培养保持恒定流速微生物的生长与环境条件第34页（一）恒浊连续培养测定所培养微生物光密度值自动调整新鲜培养基流入和培养物流出培养室流速使培养物维持在某一恒定浊度当培养室中浊度超出预期数值时，流速加紧，使浊度降低；当培养室中浊度低于预期数值时，流速减慢，使浊度升高；恒浊培养器工作精度是由光电控制系统灵敏度来决定微生物的生长与环境条件第35页（二）恒化连续培养使培养液流速保持不变，并使微生物在恒定生长速率下进行生长繁殖。微生物的生长与环境条件第36页连续培养简化流程图微生物的生长与环境条件第37页稀释率：每小时流加新鲜培养液占总培养液体积百分比微生物的生长与环境条件第38页第二节、微生物个体生长和分化第三节、环境条件对微生物生长和代谢影响微生物的生长与环境条件第39页1、温度低温型微生物：专性低温微生物和兼性低温微生物中温型微生物：分布最广高温型微生物：嗜热微生物和极端嗜热微生物一、控制微生物物理原因最低温度最适温度最高温度微生物的生长与环境条件第40页低温型微生物中温型微生物高温型微生物微生物的生长与环境条件第41页(1)干热灭菌烘箱内热空气灭菌火焰灼烧干热灭菌160-170℃，2小时高温使蛋白质、核酸等主要生物大分子发生变性、破坏，以及破坏细胞膜上类脂成份，造成微生物死亡。高温杀菌微生物的生长与环境条件第42页(2)湿热灭菌湿热比干热灭菌更加好：水蒸汽气化热高，更易于传递热量；湿热对普通营养体和孢子杀灭条件：多数细菌和真菌营养细胞：在60℃左右处理5-10分钟；酵母菌和真菌孢子：用80℃以上温度处理；细菌芽孢：121℃处理10分钟以上；微生物的生长与环境条件第43页各种细菌芽孢在湿热中

致死温度和致死时间菌种100oC105oC110oC115oC121oC炭疽芽孢杆菌5~10____枯草芽孢杆菌6~17____嗜热脂肪芽孢杆菌____12肉毒梭状芽孢杆菌33010032104破伤风梭菌5~155~10___微生物的生长与环境条件第44页蒸气压力温度（℃）磅/平方厘米千克/平方厘米kPa50.3533.78108.880.5754.04113.0100.7067.55115.6151.0101.33121.3201.46135.10126.2251.77168.88130.4302.10202.66134.6微生物的生长与环境条件第45页微生物的生长与环境条件第46页空气排除程度与温度关系压力表读数灭菌器内温度/℃/Pa未排除空气排除1/3空气排除1/2空气排除2/3空气完全排除气35701051401752107290941001099010010510911510010911211512110911511812112611512112412613012l126128130135微生物的生长与环境条件第47页（3）其它湿热灭菌方式1）巴斯德消毒（pasteurization）60-85℃处理15秒至30分钟2）煮沸消毒3）间歇灭菌（fractionalsterilizationORtyndallization）4）瞬间加压灭菌（continuousautoclaving）135-150℃，5-15秒，工业上发酵培养基135-150℃，2-6秒，牛奶或其它液态食品（超高温灭菌）微生物的生长与环境条件第48页UTH超高温灭菌乳是在本世纪60年代出现一个产品，首先是由英国巴顿等研究者提出。其原理是依据牛奶在加热中细菌灭菌效果（SE），也就是杀孢子效率伴随温度上升，大大快于牛乳中化学改变（褐变、维生素破坏、蛋白质变性等）。

在温度有效范围内，热处理温度每升高10℃，牛乳中所含细菌孢子破坏速度性提升11-30倍，而牛乳中化学改变褐变速度仅提升2.5-3倍，Q10=2.5-3。这意味着温度越高，其灭菌效果越大，而引发化学改变很小。微生物的生长与环境条件第49页低温保藏菌种，实践中，采取低温保藏食品，预防杂菌生长

斜面:4℃

石蜡油:4℃

沙土管:4℃

甘油管:-70℃,液氮

冻干管:4℃

水:常温

微生物的生长与环境条件第50页2、辐射作用辐射灭菌(RadiationSterilization)是利用电磁辐射产生电磁波杀死大多数物质上微生物一个有效方法。用于灭菌电磁波有紫外线(UV)、X-射线和γ-射线等微生物的生长与环境条件第51页电磁波灭菌机理：微生物的生长与环境条件第52页UV引发DNA断裂、DNA分子双链交联以及嘧啶二聚体形成等，其中形成胸腺嘧啶二聚体是最主要作用。胸腺嘧啶二聚体会妨碍双链解链与复制、碱基正常配对，引发突变。生成臭氧胸腺嘧啶二聚体

微生物的生长与环境条件第53页电离辐射诱变剂:x射线、γ射线、快中子、α射线、β射线和超声波等，在微生物诱变育种中以前面四种用得比较多。直接作用:辐射量子击中染色体，造成发生直接原始损伤。间接作用:辐射作用使得细胞中分子尤其是大量水分子产生电离，进而形成各种自由基，这些自由基团再深入与细胞内活性大分子产生一系列生物化学反应，造成染色体损伤，造成突变。微生物的生长与环境条件第54页可见光（400-760nm）：紫外线（200-400nm）：电离辐射：杀菌效果不显著杀菌效果显著，但穿透能力不强，只能用于表面灭菌。波长短，能量高，穿透能力强，杀菌效果很显著微生物的生长与环境条件第55页3、氧气氧气对微生物毒害机制：产生活性氧（超氧负离子、过氧化氢、羟基自由基）据微生物对氧气敏感性：好氧微生物、厌氧微生物O2+e-→O2-2O2-+2H+→H2O2+O2O2-+H2O2→O2+OH-+OH·微生物的生长与环境条件第56页好氧菌消除活性氧伤害机制：产生SOD、过氧化氢酶和过氧化物酶消除活性氧2O2-+2H+→H2O22H2O2→O2+2H2O2H2O2+NADH+H+→NAD++2H2O超氧化物歧化酶接触酶过氧化物酶微生物的生长与环境条件第57页二、控制微生物化学原因：各种有机或无机杀菌剂或抑菌剂微生物的生长与环境条件第58页机理：蛋白质变性代表：苯酚（石炭酸）（1）酚：1、有机化合物应用范围：地面，家俱，皮肤等石炭酸系数：指在一定时间内被试药剂能杀死全部供试菌最高稀释度和到达同效石炭酸最高稀释度比率。普通要求处理时间为10分钟，而供试菌定为Salmonellatyphi（伤寒沙门氏菌）。微生物的生长与环境条件第59页（2）醇机理：蛋白质变性、细胞脱水代表：乙醇（75%）应用范围：器械、皮肤微生物的生长与环境条件第60页（3）醛机理：蛋白质变性代表：福尔马林液（40%甲醛）应用范围：熏蒸、标本保藏微生物的生长与环境条件第61页（4）酸机理：蛋白质变性代表：醋酸、苯甲酸、山梨酸应用范围：房间消毒、防腐剂微生物的生长与环境条件第62页（5）表面活性剂机理：破坏细胞膜代表：新洁尔灭、洗衣粉、洗涤剂等应用范围：器械、皮肤微生物的生长与环境条件第63页2、无机化合物:卤化物、重金属、氧化剂等（1）卤化物：碘、和氯机理：破坏细胞膜代表：碘酒、漂白粉、氯气应用范围：碘酒-皮肤氯气-自来水、游泳池、澡堂漂白粉-地面微生物的生长与环境条件第64页机理：与蛋白质中巯基结合代表：升汞、硫酸铜应用范围：非金属器皿表面消