zj基因工程第章(工具酶)

现在是1页\一共有91页\编辑于星期一重组DNA技术所需的基本条件A用于核酸操作的工具酶B用于基因克隆的载体C用于基因转移的受体菌或细胞现在是2页\一共有91页\编辑于星期一第二章基因工程工具酶现在是3页\一共有91页\编辑于星期一现在是4页\一共有91页\编辑于星期一用于核酸操作的工具酶

限制性核酸内切酶

DNA连接酶

DNA聚合酶核酸酶核酸修饰酶现在是5页\一共有91页\编辑于星期一切:

限制性内切酶

“分子手术刀”现在是6页\一共有91页\编辑于星期一第一节限制性核酸内切酶

宿主细胞的限制和修饰现象限制性核酸内切酶的发现及类型限制性核酸内切酶的命名Ⅱ限制性核酸内切酶的功能Ⅱ型限制性核酸内切酶的反应条件影响限制性核酸内切酶活性的因素限制性核酸内切酶的星活性甲基化酶及其基本特征现在是7页\一共有91页\编辑于星期一仍有少量phageλ(K)可在E.coliB中生存，是因为E.coliBphage对λ(K)进行了修饰。大肠杆菌B大肠杆菌K修饰的phageλ(B)修饰的phageλ(K)10-4（限制作用）10-4（限制作用）1（修饰作用）1宿主细胞的限制和修饰现象现在是8页\一共有91页\编辑于星期一限制性内切酶

能识别并切断外来DNA分子的某些部位，使外来DNA失去活性，限制外来噬菌体的繁殖，把这类酶称为限制性核酸内切酶。现在是9页\一共有91页\编辑于星期一限制(restriction)：指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA，导致噬菌体的寄主幅度受到限制。限制作用：实际就是限制性内切酶降解外源DNA，维护宿主遗传稳定的保护机制。修饰(modification)：指寄主本身的DNA，由于在合成后通过甲基化酶的作用得以甲基化，使DNA得以修饰,从而免遭自身限制性酶的破坏。修饰作用：宿主细胞通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。现在是10页\一共有91页\编辑于星期一NNNNNNNNNNNNGGATCCNNNNNNNNNNNNNNNBamHⅠ5’3’NNNNNNNNNNNNAGCTNNNNNNNNNNNNNNNAluⅠ5’3’现在是11页\一共有91页\编辑于星期一1968年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindII和HindIII识别双链DNA分子中的特定序列，并切割DNA双链；主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵细菌的限制与修饰作用。hsdR：编码限制性核酸内切酶hsdM：编码限制性甲基化酶hsdS：编码限制性酶和甲基化酶的协同表达2限制性核酸内切酶的发现及类型现在是12页\一共有91页\编辑于星期一2限制性核酸内切酶的发现及类型主要特性I型II型III型限制修饰蛋白结构辅助因子识别序列切割位点多功能异源三聚体ATPMg2+SAMTGAN8TGCTAACN6GTGC距识别序列1kb处随机性切割单功能同源二聚体Mg2+

旋转对称序列识别序列内或附近特异性切割双功能异源二聚体ATPMg2+SAMGAGCCCAGCAG距识别序列下游24-26bp处随机性切割现在是13页\一共有91页\编辑于星期一属名

种名

株名Haemophilus

influenzae

d

流感嗜血杆菌d株

HindⅡ

HindⅢ同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶3限制性核酸内切酶的命名现在是14页\一共有91页\编辑于星期一4Ⅱ限制性核酸内切酶的功能4.1II型限制性核酸内切酶的识别序列及切割方式识别位点

识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构

EcoRI的切割位点

EcoRI的识别位点5`…GCTGAATTCGAG…3`3`…CGACTTAAGCTC…5`现在是15页\一共有91页\编辑于星期一PvuII等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C…5’切割类型及产生末端特征现在是16页\一共有91页\编辑于星期一EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-G

A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A

G-C-T-C…5’OHPOHP现在是17页\一共有91页\编辑于星期一PstI等产生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

OH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP现在是18页\一共有91页\编辑于星期一4.2同裂酶与同尾酶同裂酶(isoschizomers):有一些来源不同的限制性核酸内切酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶称为同裂酶。

例：SmaI和XmaI(CCCGGG)。同尾酶(isocaudamer):有一些来源不同的限制性核酸内切酶识别的靶序列也各不相同，但都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。例：BamHI(GGATCC))和BglⅡ(AGATCT)。

现在是19页\一共有91页\编辑于星期一5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHⅠ5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’BclⅠ5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡBamHⅠBclⅠBglⅡ三种酶可产生相同的5’GATC粘性末端，由这种同尾酶产生的DNA片段可因粘性末端的互补而彼此再连接起来。现在是20页\一共有91页\编辑于星期一5Ⅱ型限制性核酸内切酶的反应条件5.1标准酶切体系的建立大部分II型限制性核酸内切酶需要相似的反应条件：Tris-HCL50mMpH7.5MgCL210mMNaCL0-150mMDTT1mMVolume20-100ulTT37℃1-2.5h1U核酸内切酶的酶活性：在最佳反应条件下反应1小时，完全水解1ug标准DNA所需的酶量现在是21页\一共有91页\编辑于星期一

1)将DNA溶液加入一灭菌的微量离心管中并与适量水混匀，使总体积为18uL。 2)加入2uL适当的10×限制酶消化缓冲液，轻敲管外壁混匀。 3)加入1～2单位限制酶，轻弹管外壁混匀。 4)将上述混合的反应物置于适当温度并按所需的时间进行温育。 5)反应终止现在是22页\一共有91页\编辑于星期一II型核酸内切酶的多酶联合酶解：当DNA需2种或以上酶切时，应用通用缓冲液。

若没有通用缓冲液时，使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解。低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切。II型核酸内切酶酶切反应的终止65℃，温浴5分钟（常用）加入终止液（如EDTA）加入等体积的酚，抽提酶解产物现在是23页\一共有91页\编辑于星期一5.2Ⅱ限制性核酸内切酶对DNA分子的不完全酶解

减少酶量；增加反应体积；缩短反应时间；降低反应温度；现在是24页\一共有91页\编辑于星期一5.3Ⅱ限制性核酸内切酶操作的注意事项

商品化的限制性核酸内切酶均为浓缩液，每次操作时应使用新的吸头去取酶，加入酶的体积应不超过总体积的10%，否则酶液中的甘油浓度超过5%时将会抑制酶的活性。整个操作应在0℃进行，即在冰浴中进行，而且是在加入其它试剂之后，最后加入酶。当切割大量DNA时，通常采用延长反应时间，减少酶的用量。现在是25页\一共有91页\编辑于星期一6影响限制性核酸内切酶活性的因素6.1DNA样品的纯度：

蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCL提高限制性内切酶对低纯度DNA的反应效率的方法加大酶的用量，1ugDNA用10U酶加大反应总体积延长反应时间现在是26页\一共有91页\编辑于星期一6.2DNA样品的甲基化程度：大肠杆菌中的dam甲基化酶在5`-GATC-3`序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有BclIMbol等，但BamHIBglII不受影响。大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5`-CCAGG-3`或5`-CCTGG-3`序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoRII等现在是27页\一共有91页\编辑于星期一6.3酶的纯度6.4酶切反应的温度与时间6.5DNA分子的构型6.6限制性核酸内切酶的反应缓冲液现在是28页\一共有91页\编辑于星期一

7Ⅱ限制性核酸内切酶的星活性高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的“星活性（Staractivity）”现象EcoRI在正常条件下识别并切割5`-GAATTC-3`序列，但在甘油浓度超过5%（V/V）时，也可切割5`-PuPuATPyPy-3`或者5`-AATT-3`现在是29页\一共有91页\编辑于星期一星活性产生的原因如下：

反应体系中甘油的浓度大于5%。酶用量过大，大于100U/微克DNA。低离子强度，小于25mmol/L。高pH，大于8.0。含有机剂，如乙醇、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺等。Mn2+、Cu2+、Co2+、Zn2+等非Mg2+的二价离子的存在。现在是30页\一共有91页\编辑于星期一Ⅱ类R-M系统由限制性核酸内切酶和甲基化酶两种酶分子组成。大多数限制酶都已分离出相应的甲基化酶。甲基化酶也称修饰酶(modificationenzyme)，用来修饰限制酶的识别序列，在该序列位点的胞嘧啶（C）5-氨基上加一个甲基，使得该序列可以被限制性内切酶识别而免于切割。

8甲基化酶(methylase)现在是31页\一共有91页\编辑于星期一甲基化酶分两类：维持性甲基化酶：用于在新合成的DNA链上进行甲基化的酶。甲基化位置与模板链上的相同。构建性甲基化酶：用于在非甲基化的DNA链上进行甲基化的酶。用甲基化酶进行甲基化的作用封闭DNA链中的某些识别位点，保护多余的限制性酶切位点。构建新的酶切位点现在是32页\一共有91页\编辑于星期一接:

DNA连接酶

“分子针线”现在是33页\一共有91页\编辑于星期一第二节DNA连接酶

DNA连接酶的基本性质及作用机理DNA连接酶的种类DNA连接酶的连接反应影响连接反应的因素现在是34页\一共有91页\编辑于星期一1DNA连接酶的基本性质及作用机理现在是35页\一共有91页\编辑于星期一1DNA连接酶的基本性质及作用机理

修复双链DNA缺口处的磷酸二酯键DNA连接酶5‘…G-C-T-C-T-G-C-A

G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C…5’nicknick现在是36页\一共有91页\编辑于星期一T4-DNA连接酶5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G

A-C-G-G-C-C-T-C…5’OHPnick5‘…G-C-U-C-U-G-C-C-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-G-C-C-T-C…5’1DNA连接酶的基本性质及作用机理

修复与RNA结合的DNA链上缺口处的磷酸二酯键现在是37页\一共有91页\编辑于星期一1DNA连接酶的基本性质及作用机理

连接多个平头双链DNA分子5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C

…5’5‘…G-C-T-C-A-G-OH

P-C-T-G-G-A-G

…3’3‘…C-G-A-G-T-C-P

OH-G-A-C-C-T-C

…5’T4-DNA连接酶现在是38页\一共有91页\编辑于星期一2DNA连接酶的种类T4噬菌体DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶T4噬菌体RNA连接酶热稳定的DNA连接酶现在是39页\一共有91页\编辑于星期一Tris-HCL50-100mMpH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20uLTT4-15℃4-16h1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15℃反应1小时，完全连接1ugλ-DNA（HindIII片段）所需的酶量。3DNA连接酶的连接反应现在是40页\一共有91页\编辑于星期一T4-DNA连接酶：

T4-噬菌体连接温度：不高于粘性末端熔点温度（Tm）

≤15℃：15℃/6h；12℃/8h；8℃/12h；现在是41页\一共有91页\编辑于星期一连接方式：

相同粘性末端的连接

平头末端的连接现在是42页\一共有91页\编辑于星期一平头双链DNA片段的连接操作从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢的多提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会。加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200mM现在是43页\一共有91页\编辑于星期一4影响连接反应的因素DNA末端的浓度反应温度

不高于粘性末端熔点温度（Tm）

≤15℃：15℃/6h；12℃/8h；8℃/12h；ATP浓度酶的用量现在是44页\一共有91页\编辑于星期一第三节DNA聚合酶

大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段T4噬菌体DNA聚合酶测序酶TaqDNA聚合酶逆转录酶现在是45页\一共有91页\编辑于星期一DNA聚合酶的种类现在是46页\一共有91页\编辑于星期一1大肠杆菌DNA聚合酶I（DNApolI）5‘→3‘的DNA聚合酶活性5‘→3‘的核酸外切酶活性3‘→5‘的核酸外切酶活性3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-OH5‘pppdNMg2+3‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-A…5’5‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-OHDNApolI现在是47页\一共有91页\编辑于星期一三种酶活性DNA聚合活性

dTTP3'3'ATGCAATTGC5'||||5`

TACGppi

T现在是48页\一共有91页\编辑于星期一聚合反应的特点：

1、聚合反应具有方向性:5’3’2、DNA聚合酶不能催化两个游离的脱氧核苷酸聚合，只能在一段寡核苷酸的3`-OH逐个添加脱氧核苷酸，使核苷酸链不断延长。3’3’引物现在是49页\一共有91页\编辑于星期一核酸外切酶活性5’AGCTTCAGGATA3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAG5’现在是50页\一共有91页\编辑于星期一5’AGCTTCAGGATA3’

|||||||||||3’TCGAAGTCCTAGCGAC5’?3’5’外切酶活性

能辨认错配的碱基对，并将其水解5’3’外切酶活性

能切除突变的DNA片段

AC现在是51页\一共有91页\编辑于星期一应用切口移位法标记DNA

在DNase的作用基础上产生链内切口，应用此酶的5’→3’聚合酶活性和5’→3’外切核酸酶活性的同步联合反应，使切口沿DNA链从5’-端向3’-端移动。若用于聚合反应的原料dNTP带有放射性核素α32P，就能使生成的双链带有标记物。5’3’现在是52页\一共有91页\编辑于星期一现在是53页\一共有91页\编辑于星期一3’-粘端的末端标记先利用此酶的3’→5’外切核酸酶活性，切除凸出的3’-粘端，形成5’-凸出粘端；再以其5’→3’聚合酶活性使其补平，在高浓度的dNTP条件下，使3’-端的外切反应与dNTP的搀入反应达到平衡。若dNTP中有放射性标记的核苷酸，即可使产物成为3’-末端带标记的DNA。3’5’5’3’现在是54页\一共有91页\编辑于星期一合成cDNA的第二链cDNA5’3’5’3’现在是55页\一共有91页\编辑于星期一2大肠杆菌DNA聚合酶I大片段（Klenow）大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶处理，获得Ｃ端三分之二的大肽段，即为Klenow酶Klenow酶仍拥有5`→3`的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性，但失去了5`→3`的核酸外切酶活性。现在是56页\一共有91页\编辑于星期一小片段N端C端木瓜蛋白酶大肠杆菌DNA聚合酶I5核酸外切酶活性大片段（

Klenow片段）

DNA聚合酶活性

5核酸外切酶活性现在是57页\一共有91页\编辑于星期一Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5`粘性末端DNA片段的同位素末端标记cDNA第二链的合成双脱氧末端终止法测定DNA序列现在是58页\一共有91页\编辑于星期一Klenow酶的基本用途：补平由核酸内切酶产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’KlenowdATPdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’现在是59页\一共有91页\编辑于星期一Klenow酶的基本用途：DNA片段的同位素末端标记5‘…G-C-T-G-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-G-C-T-C…5’Klenowa-32P-pppdAdTTP5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-OH

P-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-P

OH-T-T-A-A-G-C-T-C…5’现在是60页\一共有91页\编辑于星期一3T4-DNA聚合酶基本特性：

5`→3的DNA聚合酶活性和3`→5`的核酸外切酶活性；在无dNTP时，可以从任何3`-OH端外切；在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止；在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位；现在是61页\一共有91页\编辑于星期一T4-DNA聚合酶的基本用途：切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-A-C-G-T-C-C-T-C…5’T4-DNA聚合酶5‘…G-C-T-C-OH

P-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-P

HO-C-C-T-C…5’注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多现在是62页\一共有91页\编辑于星期一T4-DNA聚合酶的基本用途：DNA片段的同位素末端标记5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘Mg2+5‘pppdN5‘pppdA（a-32P-dATP）5‘G-C-T-CA-G-C-T-G-OH

HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘T4-DNApolT4-DNApol5‘G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T3’3‘C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A5‘现在是63页\一共有91页\编辑于星期一4T7DNA聚合酶与测序酶T7DNA聚合酶来源于T7噬菌体感染的大肠杆菌，持续合成能力很强。对T7DNA聚合酶进行化学修饰或基因工程改造，去除该酶的3`-5`外切酶活性，而保留其聚合活性，即为测序酶。现在是64页\一共有91页\编辑于星期一TaqDNA聚合酶是从栖热水生菌(Thermusaquaticus)中分离纯化的依赖DNA的DNA聚合酶。最适温度75℃~80℃。对基因的克隆、测序、突变研究和检测诊断等方面发挥巨大的作用。5TaqDNA聚合酶现在是65页\一共有91页\编辑于星期一6依赖于RNA的DNA聚合（反转录酶）反转录酶的基本特性：以RNA为模板聚合cDNA链3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA反转录酶Mg2+dNTP5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA现在是66页\一共有91页\编辑于星期一反转录酶的基本特性：双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链反转录酶3’RNA5’DNA3’5’3’RNA5’DNA3’5’反转录酶5’DNA3’现在是67页\一共有91页\编辑于星期一1975年，H.TeminRNA病毒:劳斯鸡肉瘤病毒放线菌素D(-)(-)DNA合成RNADNA(前病毒)RNA

“前病毒假说”现在是68页\一共有91页\编辑于星期一逆转录病毒细胞内的逆转录现象：

RNA模板逆转录酶DNA-RNA

杂化双链RNA酶单链DNA双链DNA*逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样具有遗传物质的传代与表达功能。现在是69页\一共有91页\编辑于星期一逆转录酶的应用:应用于基因工程基因mRNA蛋白质多肽链现在是70页\一共有91页\编辑于星期一基因重组反转录酶mRNAcDNA

cDNA文库的组建现在是71页\一共有91页\编辑于星期一第四节核酸酶

核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶S1核酸酶Bal31核酸酶脱氧核糖核酸酶大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ大肠杆菌核酸外切酶Ⅲ核糖核酸酶A核糖核酸酶T1核糖核酸酶H现在是72页\一共有91页\编辑于星期一核酸酶是一类降解核酸的水解酶

1核糖核酸酶1.1核糖核酸酶A（RNaseA)来源于牛胰脏，攻击RNA上嘧啶残基的3`端，水解胞嘧啶或尿嘧啶与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。用途：（1）去除DNA：RNA杂交体中未杂交的RNA区。（2）RNA检测。（3）消化DNA样品中的RNA分子。现在是73页\一共有91页\编辑于星期一1.2核糖核酸酶T1（RNaseT1)来源于米曲霉，攻击RNA上鸟嘌呤的3`端磷酸，鸟嘌呤的3`端磷酸与相邻核苷酸形成的磷酸二酯键。1.3核糖核酸酶H（RNaseH)来源于小牛胸腺，特异性降解DNA：RNA杂交链中的RNA链。现在是74页\一共有91页\编辑于星期一3’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA反转录酶Mg2+dNTP5’TTTTTTTTTTTToligo(dT)12-183’AAAAAAAAAAAAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNARNaseH3’AAAA

AAA

AAAA5’mRNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNADNApolI3’AAAAAAAAAAAAAA5’cDNA5’TTTTTTTTTTTTTT3’cDNA现在是75页\一共有91页\编辑于星期一用途：（1）参于切口平移；（2）使用DNaseI足迹法测定DNA结合蛋白的位置；（3）通过鸟枪法，制备DNA文库；（4）消化RNA样品中的DNA分子；2脱氧核糖核酸酶2.1脱氧核糖核酸酶I（DNaseI)来源于牛胰脏，从嘧啶残基的5`端随机降解单链或双链DNA，或在Mg2+存在下在双链DNA分子上随机产生切口。现在是76页\一共有91页\编辑于星期一2.2双链核酸外切酶（exoⅦ)ExoVII3’5’3’5’3’5’3’5’可使DNA分子变为平头末端，不需要Mg2+现在是77页\一共有91页\编辑于星期一2.3双链核酸外切酶（exoⅢ)ExoⅢ3’5’3’5’Mg2+3’5’3’5’现在是78页\一共有91页\编辑于星期一2.4λ核酸外切酶（λExo）lExo3’5’3’5’Mg2+l核酸外切酶特异性地从5‘端外切3’5’3’5’现在是79页\一共有91页\编辑于星期一3单链核酸内切酶（S1核酸酶）S1核酸酶的基本特性：来自稻谷曲霉菌；降解单链DNA或RNA；包括双链分子中的单链区降解单链DNA的速度比降解双链DNA快75000倍降解单链DNA的速度比降解单链RNA快7倍最适pH范围为4.0---4.3需要NaCl10-300mMZn2+必需现在是80页\一共有91页\编辑于星期一S1核酸酶的基本反应：内切单链DNA或RNA5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T…3’S1Zn2+5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-CT-T-G-A-G-G-A-G-T…3’5‘…G-C-T-CA-G-C-T-CT-T-G-A-GG-A-G-T…3’5‘dNMPs或5‘NMPs现在是81页\一共有91页\编辑于星期一S1核酸酶的基本反应：内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA5‘…G-C-T-