仪器分析法紫外可见分光光度法课件

仪器分析法—紫外可见分光光度法Contents：概述generalization光的吸收定律—朗伯—比尔定律紫外—可见分光光度计分光光度法分析条件的选择41232.1概述generalization

分光光度法是基于物质分子对光的选择性吸收而建立起来的分析方法。按物质吸收光的波长不同，可分为可见分光光度法、紫外分光光度法及红外分光光度法。特点：*灵敏度较高，适用于微量组分的测定。但相对误差较大。*具有操作方便、仪器设备简单、灵敏度和选择性较好等优点，为常规的仪器分析方法。一．分子吸收光谱(molecularabsorptionspectrum)在分子中存在着电子的运动，以及组成分子的各原子间的振动和分子作为整体的转动。分子的总能量可以认为等于这三种运动能量之和。即：

E分子=E电子+E振动+E转动如果用△

E电子，△

E振动以及△E转动表示各能级差，则：△

E­电子＞△

E­振动＞△E­转动

由分子中的电子能级、振动能级和转动能级跃迁产生的光谱分别称为电子光谱、振动光谱和转动光谱。其对应的波谱区范围如下：

ΔEeΔEvΔEr电子光谱

振动光谱

转动光谱

紫外可见光

近红外、中红外区

远红外、微波区

由于分子选择性的吸收了某些波长的光，所以这些光的能量就会降低，将这些波长的光及其所吸收的能量按一定顺序排列起来，就得到了分子的吸收光谱。了解紫外—可见吸收光谱图：

最大吸收峰：最大吸收波长次峰：最小吸收波长末端吸收C

H

H

O

o

ooo=

=

o=n有机分子能级跃迁有机分子包括:成键轨道

、

；反键轨道

*、*非键轨道

n

例如

CH2O分子的轨道：

*

n*

n**

*n

2、n→σ*跃迁，所需的能量比σ→σ*跃迁所需的能量少，吸收光谱的波长一般在150—250nm处。一般发生在有机化合物中的H被杂原子取代后的产物中，如碘代乙烷的吸收峰在259nm处。

这种能使吸收峰向长波方向移动而产生红移现象的原子团称为助色团。红移与蓝移——在有机化合物中，常常由于取代基的变更或溶剂的改变，使化合物的最大吸收包产发生移动，向长波方向移动称为红移动，向短波方向移动称为蓝移。

3、不饱和有机化合物的电子跃迁类型为n→π*，π→π*跃迁，所需的能量较低，吸收峰一般大于200nm。

这两类跃迁都要求有机化合物的分子中含有不饱和键的官能团，这种含有不饱和键的基团称为生色团。

在以上几种跃迁中，只有-*和n-*两种跃迁的能量小，相应波长出现在近紫外区甚至可见光区，且对光的吸收强烈，是我们研究的重点。5.影响紫外—可见吸收光谱的因素影响：谱带位移；谱带强度的变化等。谱带位移：表现为物质的最大吸收波长发生移动，包括有红移和蓝移。谱带强度的变化：包括增色效应（吸收强度增加）与减色效应（吸收强度减小）。影响的因素：（1）共轭效应的影响A：π电子共轭体系增大，最大吸收波长红移，吸收强度也增加。这是由于共轭效应，使得电子离域到多个原子之间，导致π-π*跃迁能量降低。同时跃迁的几率也增大，则吸收强度也随之增大。B空间阻碍使共轭体系破坏，最大吸收波长蓝移，吸收强度减小。（2）取代基的影响（3）溶剂的影响A溶剂的极性不同往往会引起某些化合物吸收光谱的红移或蓝移。B溶剂的酸度影响对于具有酸碱性的被测物质，溶剂的pH变化，则溶质的存在形式也发生变化，使分子中共轭效应发生改变，则使吸收红移或蓝移。2.2光的吸收定律—Lambert-beer定律Lightabsorptionlaw---Lambert-beerlaw

光的选择性吸收与物质颜色的关系：1．可见光的颜色和互补色：

在可见光范围内，不同波长的光的颜色是不同的。平常所见的白光（日光、白炽灯光等）是一种复合光，它是由各种颜色的光按一定比例混合而得的。利用棱镜等分光器可将它分解成红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等不同颜色的单色光。

白光除了可由所有波长的可见光复合得到外，还可由适当的两种颜色的光按一定比例复合得到。能复合成白光的两种颜色的光叫互补色光。

2、物质的颜色与吸收光的关系：当白光照射到物质上时，如果物质对白光中某种颜色的光产生了选择性的吸收，则物质就会显示出一定的颜色。物质所显示的颜色是吸收光的互补色。/nm

颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿单色光(monochromaticlight)只具有一种波长的光。混合光由两种以上波长组成的光。白光是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等各种色光按一定比例混合而成的。物质的颜色

是由于物质对不同波长的光具有选择性的吸收作用而产生的。一、朗伯—比尔定律Lambert-beerlaw

透光率

（透射比）Transmittance透光率定义：T取值为0.0%~100.0%全部吸收T=0.0%全部透射T=100.0%入射光

I0透射光

Itc的单位为mol·L-1b的单位为cm这时k常用

表示。称为摩尔吸光系数(molarabsorptivity)，其单位为L·mol-1·cm-1

A=εbc例题：

用邻二氮菲分光光度法测铁。已知溶液中Fe2+的浓度为500g·L-1

，液层厚度为2cm，在508nm处测得透射比为0.645。

计算：吸光系数

a、摩尔吸收系数(MFe=55.85g·mol-1)解：A=-lgT=-lg0.645=0.190（三位有效数字）c=500g·L-1=5.00×10-4g·L-1

b=2cm②①

定量分析时，通常液层厚度是相同的，按照比尔定律，浓度与吸光度之间的关系应该是一条通过直角坐标原点的直线。但在实际工作中，往往会偏离线性而发生弯曲。若在弯曲部分进行定量，将产生较大的测定误差二

偏离朗伯一比尔定律的因素

朗伯一比尔定律只对一定波长的单色光才能成立，但在实际工作中，即使质量较好的分光光度计所得的入射光，仍然具有一定波长范围的波带宽度。在这种情况下，吸光度与浓度并不完全成直线关系，因而导致了对朗伯一比尔定律的偏离。所得入射光的波长范围越窄，即“单色光”越纯，则偏离越小。

（一）非单色光所引起的偏离

（二）非吸收作用引起的偏离

非吸收作用引起的对朗伯一比尔定律的偏离，主要有散射效应和荧光效应，一般情况下荧光效应对分光光度法产生的影响较小。

散射效应：朗伯一比尔定律只适用于十分均匀的吸收体系。当待测液的体系不是很均匀时，入射光通过待测液后将产生光的散射而损失，导致吸收体系的透过率减小，造成实测吸光值增加

朗伯—比尔定律是建立在均匀、非散射的溶液这个基础上的。如果介质不均匀，呈胶体、乳浊、悬浮状态，则入射光除了被吸收外，还会有反射、散射的损失，因而实际测得的吸光度增大，导致对朗伯—比尔定律的偏离荧光效应:

当入射光通过待测液，若吸光物质分子吸收辐射能后所产生的激发态分子以发射辐射能的方式回到基态而发射荧光，结果必然使待测液的透光率相对增大，造成实测吸光值减小。

溶质的离解、缔合、互变异构及化学变化也会引起偏离。其中有色化合物的离解是偏离朗伯—比尔定律的主要化学因素。例如，显色剂KSCN与Fe3+形成红色配合物Fe(SCN)3，存在下列平衡：

Fe(SCN)3Fe3++3SCN－

（三）化学反应引起的偏离

溶液稀释时，上述平衡向右，离解度增大。所以当溶液体积增大一倍时，Fe(SCN)3的浓度不止降低一半，故吸光度降低一半以上，导致偏离朗伯—比尔定律。2.3紫外—可见分光光度计UV-VisSpectrophotometers

一、基本组成

generalprocess

光源单色器样品室检测器显示

1.光源

在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。

可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。

紫外区：氢、氘灯。发射180～375nm的连续光谱。

2.单色器

将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。

①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；

②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束

③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。3.样品室

样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一般用玻璃池。4.检测器

利用光电效应将透过吸收池的光信号变成可测的电信号，常用的有光电池、光电管或光电倍增管。

5.结果显示记录系统

检流计、数字显示、微机进行仪器自动控制和结果处理二、分光光度计的类型

typesofspectrometer

1.单光束

简单，价廉，适于在给定波长处测量吸光度或透光度，一般不能作全波段光谱扫描，要求光源和检测器具有很高的稳定性。0.575光源单色器吸收池检测器显示

2.双光束

自动记录，快速全波段扫描。可消除光源不稳定、检测器灵敏度变化等因素的影响，特别适合于结构分析。仪器复杂，价格较高。三、仪器的主要性能指标

1、光度的准确度：是指样品在最大吸收波长处吸光度的测量值与真实值间的偏差，该偏差越小，说明仪器的准确度越高。

国际上通常采用吸光度的准确度来表示仪器的光度准确度，常用酸性重铬酸钾法进行检测。

2、波长准确度：是指仪器指示器上所指示的波长与实际所输入的波长值之间的符合程度，常用波长误差来表示。

波长准确度常用稀土玻璃进行检测。

3、杂散光：是分光光度法测量中的主要误差来源。

4、分辨率：指仪器对相邻两吸收带可分辨的最小波长的间隔能力。

5、光谱带宽：是指从单色器射出的单色光最大强度的1/2处的谱带宽度。

6、基线稳定度与平直度：指仪器在不放置样品时扫描100%T线和0%T线时读数偏离的程度或基线弯曲的程度。2.4紫外—可见分光光度法分析条件的选择一、溶剂选择的原则：

1、不与被测组分发生化学反应

2、所选溶剂在测定波长范围内无明显吸收

3、对被测组分有较好的溶解能力

4、被测组分在所选的溶剂中有较好的峰形二、测量条件的选择1、入射波长的选择：通常是根据被测组分的吸收光谱，选择最强吸收带的最大吸收波长为入射波长。当最强吸收峰的峰形比较尖锐时，往往选用吸收稍低，峰形稍平坦的次强峰进行测定。

2、狭缝宽度的选择：为了选择合适的狭缝宽度，应以减少狭缝宽度时试样的吸光度不再增加为准。一般来说，狭缝宽度大约是试样吸收峰半宽度的十分之一。

3、吸光度测量范围的选择：

由朗伯-比尔定律可知：

A=lg1/T=εcl

微分后得：

dlgT=0.4343dT/T=-εldc

或

0.4343ΔT/T=-εlΔc

代入朗伯-比尔定律有：

Δc/c=0.4343ΔT/TlgT

要使测定的相对误差Δc/c最小，求导取极小得出：

lgT=-0.4343=A

即当A=0.4343时，吸光度测量误差最小。

最适宜的测量范围为0.2~0.8之间。

4、参比溶液的选择：

测定试样溶液的吸光度，需先用参比溶液调节透光度（吸光度为0）为100%，以消除其它成分及吸光池和溶剂等对光的反射和吸收带来的测定误差。

参比溶液的选择视分析体系而定，具体有：

（1）溶剂参比

试样简单、共存其它成分对测定波长吸收弱，只考虑消除溶剂与吸收池等因素；

（2）试样参比

如果试样基体溶液在测定波长有吸收，而显色剂不与试样基体显色时，可按与显色反应相同的条件处理试样，只是不加入显色剂。（3）试剂参比

如果显色剂或其它试剂在测定波长有吸收，按显色反应相同的条件，不加入试样，同样加入试剂和溶剂作为参比溶液。（4）平行操作参比

用不含被测组分的试样，在相同的条件下与被测试样同时进行处理，由此得到平行操作参比溶液。三、反应条件的选择：

对多种物质进行测定，常利用显色反应将被测组分转变为在一定波长范围有吸收的物质。常见的显色反应有配位反应、氧化还原反应等。

显色剂

这种被测元素在某种试剂的作用下，转变成有色化合物的反应叫显色反应（colorreaction），所加入试剂称为显色剂(colorreagent)。

（一）、选择显色剂的一般原则：·选择性好

所用的显色剂仅与被测组分显色而与其它共存组分不显色，或其它组分干扰少。·灵敏度要足够高

有色化合物有大的摩尔吸光系数，一般应有104~105数量级。·有色配合物的组成要恒定

显色剂与被测物质的反应要定量进行，生成有色配合物的组成要恒定。·生成的有色配合物稳定性好即要求配合物有较大的稳定常数，有色配合物不易受外界环境条件的影响，亦不受溶液中其它化学因素的影响。有较好的重现性，结果才准确·色差大有色配合物与显色剂之间的颜色差别要大，这样试剂空白小，显色时颜色变化才明显。

（二）、显色反应条件的选择溶液的酸度

许多显色剂都是有机弱酸或有机弱碱，溶液的酸度会直接影响显色剂的解离程度。（例如二甲酚橙）

对某些能形成逐级配合物的显色反应，产物的组成会随介质酸度的改变而改变，从而影响溶液的颜色。

另外，某些金属离子会随着溶液酸度的降低而发生水解，甚至产生沉淀，使稳定性较低的有色配合物的解离。显色温度

有些反应需要加热。有些显色剂或有色配合物在较高温度下易分解褪色。此外温度对光的吸收及颜色深浅也有影响，要求标准溶液和被测溶液在测定过程中温度一致。显色时间

显色反应有快慢，有的有色配合物容易褪色，因此不同的显色反应需放置不同的时间，并在一定的时间范围内进行比色测定。

四、干扰及消除方法常用的消除干扰的方法：

1、控制酸度：提高反应的选择性

2、加入掩蔽剂：使其只与干扰离子反应生成不干扰测定的配合物。

3、改变干扰离子的价态：消除共存组分的干扰

4、改变测定波长

5、分离干扰离子2.5测定方法及其应用

一、一般定性分析及应用

（一）、有机化合物的鉴定

先扫描未知化合物的吸收光谱，然后根据其吸收光谱的特征（吸收峰的数目、形状、位置、相对强度）与相同条件下扫描得到的已知纯化合物的吸收光谱进行比较而定性。

（二）、有机化合物结构的分析

先将化合物的紫外—可见吸收光谱扫描出来，然后根据其吸收谱带及最大吸收波长处吸收值的大小，可推断出该化合物的主要基团及其所在位置。

（三）、化合物纯度的检验

将纯化合物的吸收光谱与含杂质化合物的吸收光谱进行比较，根据两者吸收光谱的差异进行纯度检验。对杂质检验的灵敏度取决于化合物与杂质间吸收系数的差异。

标准曲线法

其方法是先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。以A为纵坐标，浓度c为横坐标，绘制A-c曲线，若符合朗伯—比尔定律，则得到一条通过原点的直线，称为标准曲线。然后用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量，这就是标准曲线法。

在仪器、方法和条件都固定的情况下，标准曲线可以多次使用而不必重新制作，因而标准曲线法适用于大量的经常性的工作。二、单组分的定量测定方法及应用BlankStandardSampleSample

标准对照法(直接比较法)

将试样溶液和一个标准溶液在相同条件进行显色、定容，分别测出它们的吸光度，按下式计算被测溶液的浓度。k标=k