FCM样本制作课件

流式细胞术的样品制备汪洪涛C座402bb_4/18/20231免疫学实验中心流式细胞仪BD公司FACSCalibur4/18/20232免疫学实验中心凡是能被荧光素标记的且这种荧光素能被流式细胞仪所配置的激光光源激发的细胞或颗粒，都可用流式细胞仪检测。在生物检测技术中流式细胞仪是不可多得的一机多用的仪器。

FCM的应用广泛：4/18/20233免疫学实验中心流式参与研究的学科种类4/18/20235免疫学实验中心应用流式发表的论文统计4/18/20236免疫学实验中心怎样利用流式细胞仪进行科学研究呢？？？？4/18/20237免疫学实验中心FCM的液流系统（如何形成单个细胞流）样本管鞘液管4/18/20239免疫学实验中心2mainsortsofparametersaremeasuredLightScatterFluorescence流式的工作原理4/18/202310免疫学实验中心LightScatter流式细胞仪的散射光信号4/18/202311免疫学实验中心流式细胞仪的散射光信号FSC:表示细胞大小SSC:表示细胞内颗粒的复杂程度4/18/202313免疫学实验中心光源FSC测大小SSC测粒度SSC↑cell粒度↑FSC↑cell体积↑散射光信号流式细胞仪信号获取与分析4/18/202314免疫学实验中心外周全血细胞散射光双参数点图

（红细胞溶解后）4/18/202315免疫学实验中心Fluorescence1.自身荧光即不经荧光染色细胞经光照射后所发出的荧光A.细胞成分中能够产生的自发荧光的分子(例核黄素、细胞色素等)的含量越高，自发荧光越强；B.培养细胞中死细胞/活细胞比例越高，自发荧光越强；4/18/202317免疫学实验中心2.特异性荧光由细胞经染色结合上的荧光染料受光照而发出的荧光4/18/202318免疫学实验中心荧光染料的特性激发波长(EXCITING)发射波长(EMISSION)4/18/202319免疫学实验中心3.抗原丰富度决定荧光素的选择高密度表达的抗原我们可以应用任何荧光素标记的抗体来检测，低密度表达的抗原就需要我们应用高信噪比高的荧光素例如：细胞表面的CD3细胞产生的IFN-可以用任何荧光素标记的抗体而IL-4则最好用APC等高信噪比的荧光素标记的抗体4/18/202321免疫学实验中心DirectStainingCD4+cellplusmonoclonalantibodytoCD4conjugatedwithFITC4/18/202322免疫学实验中心IndirectStainingCD4+cellplusunconjugatedantibodytoCD4plusFITCconjugatedgoat-anti-mouseIgGassecondaryantibody.4/18/202323免疫学实验中心流式细胞仪测定的是单个粒子的荧光

要求样本必须是单细胞的悬液如何制作样本？单层培养细胞分散成单个细胞实体组织分散成单个细胞染色等操作4/18/202325免疫学实验中心实验标本的处理单细胞悬液的制备：胰酶消化抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应非特异结合的去除：洗涤和封闭封闭：血清和同型抗体4/18/202326免疫学实验中心细胞基本皱缩变圆，此时细胞吹打可下细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞从细胞瓶壁上洗下4/18/202329免疫学实验中心4.加入染色缓冲液（PBS+1%BSA），反复吹打，使之成为单细胞悬液5.移入离心管内，离心1000-1500rpm5min6.弃上清，重悬管内细胞后，加染色缓冲液，洗涤细胞4/18/202330免疫学实验中心二、实体组织分散成单个细胞机械法剪刀剪碎、手术刀切碎、匀浆器匀浆、尼龙网或者不锈钢网酶处理法胰酶、胶原酶溶菌酶木瓜蛋白酶等等单纯采用机械或者酶处理法效果都不太理想，往往是将两者结合4/18/202331免疫学实验中心实体瘤分散试验实例：1.从动物身上取瘤后，立即投入4度含有10％NCS的培养介质中2.取0.2～0.5g瘤组织并切碎3.切碎瘤组织放入混合酶液中（DNA酶＋胶原酶＋链霉蛋白酶）4.37度消化30－60min5.过滤，离心，弃上清6.用含10％NCS的培养介质洗涤细胞2次7.重悬细胞300目或者400目（37um）滤网过滤目x孔径＝154004/18/202332免疫学实验中心单细胞悬液的处理根据实验目的的不同，处理过程亦不相同细胞表面标记分子检测胞内细胞因子分析细胞周期分析细胞早期凋亡分析4/18/202333免疫学实验中心细胞表面标记分子检测－淋巴细胞亚群分析抗凝外周静脉血10～30ul染色溶血剂溶血染色缓冲液洗涤1％PFA固定15分钟上流式检测管号检测项目

荧光抗体1空白对照不加任何抗体2调补偿管Anti-CD3-FITC3调补偿管Anti-CD4-PE4同型对照IgG1-FITC/IgG2-PE5CD4+TAnti-CD3FITC+CD4PE6CD8+TantiCD3FITC+CD8PE7BcellantiCD3FITC+CD19PE8NKcellantiCD3FITC+CD16/56PE4/18/202334免疫学实验中心淋巴细胞亚群报告模式CD4+CD8+4/18/202335免疫学实验中心胞内细胞因子分析－PBMC产生IFN-测定取抗凝外周静脉血1mlPMA+Ionomysin37℃4hMonosin37℃2h收集细胞，洗涤，(表染)溶血、洗涤、固定破膜、胞内细胞因子染色洗涤，加1%PFA，检测管号荧光抗体1空白对照—2同型对照IgG1-FITC3激活对照CD69-FITC4未激活对照Anti-IFN--FITC5检测组Anti-IFN--FITC4/18/202336免疫学实验中心4/18/202337免疫学实验中心IntracellularCytokine-Protocol4/18/202338免疫学实验中心细胞周期分析-PI染色测细胞周期上机,检测、分析获取单细胞悬液，洗涤70%冷乙醇4℃2hRNaseA悬浮消化30minPI染液作用4℃30min筛网过滤管号荧光素1空白对照组—2检测组

PI上机检测4/18/202339免疫学实验中心4/18/202340免疫学实验中心细胞周期G1MG2SQuiescentcellsG04/18/202341免疫学实验中心AtypicalDNAHistogramG0-G1SG2-MFluorescenceIntensity#ofEvents4/18/202342免疫学实验中心4/18/202343免疫学实验中心细胞早期凋亡分析-AnnexinV/PI双染色法细胞收集，PBS洗涤1次AnnexinV-FITC/PI染色4℃30min