DDRT-PCR技术研究进展课件

DDRT-PCR技术及应用的研究进展

前言基因在不同组织细胞的不同生长阶段的选择性表达决定了生物的整个生命过程——个体的生长、发育、细胞周期的调控、衰老及细胞的程序性死亡等。因此分离、鉴定差异表达的基因，研究基因转录对了解生命过程的机理、发现具有特殊功能的表达产物有着重要的意义。DDRT—PCR早期，从mRNA转录水平筛选差异表达基因的方法是差别筛选技术和扣除杂交法，但二者存在灵敏度低、工作量大、周期长及步骤繁琐的问题。哈佛大学医学院Liang和Struss博士发明了mRNA差异显示技术，即DDRT—PCR(differ—entialdisplayofmRNAbyPCR)。

1994年，ErricHaay等将这种方法正式命名为差异显示反转录聚合酶链式反应(mRNADifferentialDisplayPCR)，简称DDRT—PCR

将差异带二次PCR扩增并通过Northern杂交来验证、克隆、测序差异cDNA片段。将所得片段用BLAST与Gen．Bank数据库内的已知序列做比较，确定片段是否是新序列(基因)。

2mRNA差异显示技术的优点和缺点1优点周期短，操作简便，省去了cDNA克隆和随后的克隆筛选工作，比递减杂交要迅速；可同时比较2个以上时空特异性及物种特异性表达基因；灵敏度高，所需RNA的量少，该法用PCR扩增，每做100个反应只需1IxgmRNA，而递减杂交则需50Ixg；另外，这种方法的重现性好，在相同条件下重复率可达90％～95％，大大提高了试验结果的可靠性。

2缺点

扩增片段短、假阳性高、检测全部mRNA工作量大、基因的克隆受mRNA表达的时效性影响等。而最大的问题还是假阳性太高。据研究，假阳性高达70%

所谓假阳性指克隆的DNA片段用Northern杂交时，没有阳性信号3DD-PCR中的主要问题及解决办法内部因素：试剂、酶的质量，引物的类型和纯度，RNA的完整性、浓度和纯度等外部因素：试验设计、适当的内部控制、回收带的标准、反应体系的建立、PCR管的类型及研究者操作的熟练程度等。产生假阳性的原因分析3.4克隆差异片段小的解决方法

差异显示得到的片段较小，不能代表真正差异表达的基因。为了得到全长的基因，传统方法是采用cDNA探针从cDNA文库中筛选，比较复杂。目前,人们多采用Lauren等创造的mRNA5′端逐渐步移技术，以步移法获取的片段大小多在1～1.5kb之间。另外还有一种叫RACE(cDNA末端快速扩增)的方法，也比较快速，简便。4引物的改进

起初Liang等设计的引物采用了12种锚定寡聚脱氧嘧啶核苷酸引物oligo(dT)12MN和20种不同的随机引物，缺点：不仅费时费力，由于随机引物长度短导致结果代表性差，而且得到的扩增片段也较小，所以差异条带易呈现假阳性结果。5mRNA差异显示技术在动物实验中的应用

栾新红等，利用改进后的银染DD—PCR法筛选小鼠肝脏中差异表达的基因，并进行鉴定，采用BLAST软件对阳性片段进行同源性分析。结果：经反向Northernblot和测序鉴定后，获得了7条阳性差异表达基因片段(DD—ESTs)，其中有2条DD—ESTs只在游泳疲劳组表达，2条呈现下调表达，另3条呈现上调表达5mRNA差异显示技术在动物实验中的应用

孟元光等应用mRNA差异显示技术，筛选子宫内膜癌的相关基因片段。结果发现自定义的T1.7基因片段在于官内膜癌组织中呈高表达．在增生的子宫内膜组织中呈低表达，在正常子宫内膜组织中不表达。因而得出结论T1．7基因片段可能是子宫内膜癌新的相关基因片段。

5mRNA差异显示技术在动物实验中的应用利用DDRT—PCR对不同生理状态或病理过程中基因表达进行分析，能揭示生理活动或病理过程的分子机制：Li等采用DDRT—PCR技术，发现梅山猪甲状腺激素β亚基过量表达，分析推测认为，