生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交和EMSA中的应用

生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交和EMSA中的应用第1页/共112页1.生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交和EMSA中的应用

2.WesternBlotting的问题与对策

第2页/共112页PartofThermoFisherScientificHyclone:CellcultureTechnologyPierce:ProteinChemistryDharmacon:RNAiTechnologyABgene:PCRTechnology第3页/共112页TechnicalFocus:

有机合成，化学耦联，表面化学和分析化学ProductFocus：分子生物学：各种化学发光Blotting,EMSA,RPA蛋白质组学：蛋白抽提,蛋白定量,纯化,样品制备，功能研究以及各种染色试剂和预染Markers免疫学：抗体制备,纯化，片断化,分型和修饰交联化学：交联剂，修饰试剂，生物素化试剂…PIERCE:第4页/共112页1.生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交和EMSA中的应用第5页/共112页关于生物素别名：VitaminB分子量：244.31水溶性好结合对象：亲和素Avidin链亲和素Streptavidin中性亲和素NeutrAvidin

单体亲和素MonoAvidin

第6页/共112页关于生物素/亲和素复合物亲和素亲和素Avidin链亲和素Streptavidin中性亲和素NeutrAvidin

单体亲和素MonoAvidin生物素/亲和素复合物其中与前三者的结合解离系数为

Ka=1015M-1.具有极高的结合能力，只有8M的盐酸胍在PH1.5的极端条件下或在SDS煮沸才可以将其破坏解离，而2mM生物素即可将单体亲和素与生物素标记的生物大分子置换解离。

Biotin:Avidin体系的优点：

稳定信号放大用途广泛第7页/共112页生物素/亲和素应用

BiotinAvidinTechnologyAffinityChromatographyDiagnosticsIsolation/PurificationImmobilizingAgentsFlowcytometryAffinitycytochemistryLocalizationstudiesHistochemistrySignalAmplificationCross-linkingAgentsAffinitytargetingBlottingBioaffinitysensorsEpitopeMappingCytologicalprobesProteinInteraction第8页/共112页1.1生物素标记和化学发光检测技术在核酸杂交中的应用

“Everythingispossible-withtherighttools”第9页/共112页标记：采用随机引物标记法，利用DNA聚合酶，以目标DNA为模板，在随机七核苷酸为起始引物的作用下，将生物素标记的dUTP掺入到合成的DNA探针中，产生可用于Southern或Northern杂交实验的高活性生物素标记的DNA探针检测：杂交形成双链，洗膜后，探针DNA上的生物素与HRP上的链亲和素结合，HRP与Pierce的Dura化学发光底物孵育曝光或冷光CCD检测原理第10页/共112页

North2South杂交原理和操作流程3、杂交：生物素标记的探针与靶DNA结合5、SuperSignal®Dura底物在HRP的催化下反应发光，检测2、洗膜封闭1、DNA电泳，转膜，紫外交联固定SAHRP底物B││B4、HRP标记的链亲和素与探针上的生物素结合第11页/共112页Kit组成该试剂盒由探针标记，杂交洗膜和化学发光检测三部分组成North2South™生物素随机引物Kit(该试剂盒含有足以完成10次标记反应的试剂，每次可合成至少1ug的生物素标记的探针)化学发光检测Kit89880可检测1080cm2的杂交膜.第12页/共112页探针得率高高产率：模板DNA可以少至100ng，Klenow聚合酶无核酸外切酶活，产率提高，每次标记至少产生1-2ug的生物素标记的探针。使用方便：标记好的探针可以在冰箱里保存一年。第13页/共112页检测安全采用非同位素的化学发光系统，免除放射性的危险与处理同位素废物的麻烦，减少环境污染；无须专门的同位素操作室，易于使用推广anyone,anywhereandanytime第14页/共112页高灵敏度与高信噪比生物素标记的dUTP保证了与HRP标记的链亲和素（Kd=10-15M；抗体10-5～8M

）最大结合，经受最严谨的洗膜条件优化杂交液和封闭液保证了探针与靶DNA的完美结合Dura（10-14克）底物保证了保证了高于地高辛（DIG）-AP标记系统，等同于或者超过同位素的检测灵敏度第15页/共112页方便快速0.5－10分钟即可检测到特异性信号6小时的超长发光时间允许多次曝光可以使用冷光CCD成像仪扫描成像

第16页/共112页操作流程与时间探针标记与纯化（1小时）预杂交（0.1mL/cm2,55或者65°,

0.5小时）杂交（8－12小时）严谨洗膜（3X15分钟,提高温度,降低离子强度）封闭（0.25mL/cm2,轻柔振荡15分钟）SA-HRP孵育（,1:300稀释度,轻柔振荡15分钟）洗膜（4X5分钟）平衡（5分钟）底物孵育(0.125mL/cm2,5分钟)曝光检测（0.5－10分钟）第17页/共112页1.探针制备一之探针标记将20ul生物素标记的N4-dCTP与80ul的5XdNTP混合物充分混合备用（总量100ul）稀释约100ng线性探针模板至24ul于离心管中(模板DNA要定量和纯化)加入10ul随机引物（Heptanucleotidemix）于上述离心管中，煮沸变性5分钟，迅速在冰水混合物退火5分钟加入10ulN4-dCTP与5XdNTP的混合物，5ul反应缓冲液，1ulKlenow酶片断，混匀37°孵育60分钟加入2ulEDTA以灭活Klenow酶活性第18页/共112页2.探针制备二之探针纯化加入5ul醋酸铵于上述50ul反应离心管，吹打混匀加入110ul冰预冷的无水乙醇，充分混匀，冰或－70°放置15分钟12000rpm4°离心15分钟观察沉淀情况，小心吸取出上清，风干沉淀用冰预冷的70％乙醇洗涤一次，12000rpm4°离心15分钟，观察沉淀情况，小心吸取出上清，风干沉淀50ulTE或RNA酶free的水溶解沉淀（－20℃或－70℃长期保存）第19页/共112页探针制备三之探针定量500ul去离子水，260nm调零充分混匀2.5ul探针和47.5ul去离子水（即稀释20倍）分光光度计测定OD260值定量计算公式：1OD260dsDNA=50μg/ml；样品浓度（μg/ml）=OD值X50X稀释倍数;样品浓度μg/ul=OD260值X50X20/1000样品浓度ng/ul=OD260值X50X20（注：如果稀释20倍，实际测定的OD260值应该在0.02－0.05之间）Note:大多数情况下，由于各实验室用来测定核酸的仪器不同，检测灵敏度不同以及样品中的一些干扰物质，测出的OD值往往是0甚至是负值，如果出现这种情况，再进行核酸定量没有实际价值，因此，根据经验，保守估计，在每次至少合成1ug探针的前提下，在杂交时，探针的用量按照每ul含有20ng探针来使用，即每毫升杂交液加入变性的纯化过的探针1.5-2ul.第20页/共112页2.杂交和洗膜之杂交平衡杂交液到室温预杂交:将转好的膜置于杂交管，点样面朝上，确保膜被杂交缓冲液均匀覆盖，杂交炉要缓慢转动以保证杂交液与膜能充分接触，（每平方厘米膜至少0.1ml杂交液。除了RNA:RNA杂交用65℃外，其他的都用55℃）,50-100rpm旋转，至少30分钟。热变性探针：煮沸变性10分钟，迅速在冰/盐水混合物退火5-10分钟杂交：加入已经变性的DNA探针于杂交液，充分混匀（探针加入到杂交液，不要加到膜上，要轻轻晃动，使探针均匀分散在杂交液中），探针浓度约30ng/ml杂交液,50-100rpm旋转，孵育过夜。第21页/共112页2.杂交和洗膜之严谨洗膜配制1X严谨洗膜缓冲液，平衡严谨洗膜缓冲液到室温（溶解充分），加等体积去离子水配制所需洗膜液（0.2ml/cm2膜）将膜转移到一个新的容器中（杂交管）。加入1X严谨洗膜液10－20ml，旋转洗膜3次（DNA杂交55℃，RNA:RNA杂交65℃），每次15－20分钟。第22页/共112页3.化学发光检测

Note1:要保证所有缓冲液充分溶解，没有颗粒封闭：封闭液20ml（0.25ml/cm2膜）于37－50°振荡洗膜封闭15分钟抗体孵育：20ml抗体稀释液（66.7ulSA-HRP＋20ml封闭液），室温孵育15分钟洗膜：20ml的1X漂洗缓冲液分别室温轻柔振荡漂洗4次，每次5分钟平衡：杂交膜与30ml的底物平衡液室温轻柔振荡孵育5分钟底物孵育：把湿润的膜放在一个干净的塑料盘（平皿）里，与底物工作液在室温下孵育5分钟（推荐在暗室中）。确保膜被底物溶液完全淹没或覆盖底物工作溶液需足够以完全覆盖杂交膜（约0.1ml/cm2）。曝光：滤纸吸附多余底物，作好标记，保鲜膜包裹，确保保鲜膜和杂交膜间无气泡和皱褶。把包好的杂交膜放在暗夹里，放上X光片，曝光1－5分钟。曝光时间长短可以稍有变化以获得理想的信号。从暗夹里取出X光片，按厂家的使用说明书显影和定影。

Note2:可与底片背景去除试剂配合使用，以获得更理想的实验结果第23页/共112页对照DNA点杂交

备用试剂：0.1NNaOH煮沸变性DNA变性成单链（对照DNA，5μl，250ng/μl）准备生物素标记的对照探针或阳性样品探针（见探针标记，纯化和定量）准备目标膜（注意：推荐使用带正电尼龙膜，需带无粉手套并用乙醇净化的镊子拿膜。）0.1NNaOH稀释变性DNA得到1，0.5，0.25，0.125，0.0625，0.0312，和0.015ng/μl稀释梯度。在膜上平行点两点。点前最好把膜预洗一下，半干的时候点，但干点同样有用。用1XTE轻轻漂洗膜（～10秒），微波炉高火加热2分钟，紫外交联（自动交联）或烘干固定。注：如果没有紫外交联仪，则可以将膜置于80度温箱烘烤2－3小时，可达到固定目的交联固定完，用0.1％SDS预湿润膜，进入下面预杂交，杂交以及底物孵育和曝光杂交，严谨洗膜和封闭，抗体孵育，洗膜，平衡，底物孵育以及曝光见前所述第24页/共112页-TransferBufferTransferMethodFixationFragmentsActiveGroupsNitrocellulose20XSSCorSSPECapillary1-2hr80°C>300bp~80µg/cm2sites,Nonspecific,hydrophobicNylon10XSSCor10XSSPE,or0.01-0.4NNaOHCapillary,alkaline,electroblottingUV,microwaveAllsizes,especiallysmaller~450µg/cm2sitesNomodification--reliesonUVlink+Nylon10XSSCor10XSSPE,or0.01-0.4NNaOHCapillary,alkaline,electroblotting1-2hr65-80°C,UV,microwave,alkalineAllsizesespeciallysmaller~450µg/cm2sites,Surfaceamineenhancesionic/electrostaticinteractionPVDFNaOHCapillary,alkaline1-2hr80°CAllsizesNonspecific,hydrophobicNote1:使用带正电的尼龙膜第25页/共112页片段化以确保转膜（去嘌呤）：.DNA>10kb，0.2-0.25NHCl孵育20分钟.RNA>5kb0.05NNaOH30分钟变性：0.4NNaOH漂洗30分钟中和：1MTris,pH8,0.6MNaClEB去除：0.1％SDS清洗转膜：防止核酸扩散固定：微波炉固定（TE湿润，700－900W2分钟）紫外交联（120mJ/cm2,254nm1分钟；302nm2分钟（如果没有紫外交联仪，则可以将膜置于80度温箱烘烤2－3小时，可达到固定目的）Note2:电泳，转膜，固定第26页/共112页Note3:模板与探针使用干净容器，以避免污染.模板DNA要纯化定量定量时不要稀释过度，造成读数误差纯度：A(260)/A(280)应该在1.8-2.0(DNA1.8,RNA2.0)扩增出的探针要苯酚/氯仿抽提纯化，去掉dNTP,并且准确定量杂交前的探针要变性探针浓度:RNA:3－5ng/mL;DNA:-30ng/mL第27页/共112页Note4:探针剥离

StrippingSolutionStrengthDNARNATemperatureTime0.5%SDSMildYesYes60°60min5mMTris-Cl,pH8.0,2mMEDTA,0.1XDenhardt'sReagentMildYesYes65°2hr50%Formamide,2XSSPEModerateYesYes65°1hr0.4MNaOH,0.1%(w/v)SDS*ModerateYesNo45°,+RT30min,+

2x10minBoiling0.1%SDSHarshYesYes100°removefromheat3xallowtocometoRT0.1XSSPEorSSC/0.5%SDSHarshYesYes100°removefromheat2x15min第28页/共112页问题与对策一问题原因解决方法出现斑块/点在酶、缓冲液、或底物中有不溶颗粒未稀释探针接触到了膜手套上的粉尘膜上的气泡放到适当温度，离心或过滤去除颗粒注意不要把探针打到膜上带不含粉末的手套用缓冲液和底物均匀覆盖膜第29页/共112页问题与对策二问题原因解决方法高背景探针浓度过高或未纯化太多SA-HRP未稀释的探针接触膜错误的封闭液或杂交液漂洗液溶解不完全膜预杂交不完全印迹纸降低探针浓度增加SA-HRP稀释度探针加到杂交液里检查预先拿出平衡带正电的尼龙膜增加预杂交时间膜下面用合格的滤纸（即3mm）第30页/共112页问题与对策三问题原因解决方法无信号标记失败或探针降解曝光时间太短转膜失败，错误膜HRP失活或浓度不适当严谨洗膜不够探针太少探针变性不完全靶DNA/RNA降解靶DNA/RNA浓度太低靶DNA/RNA变性不完全靶DNA/RNA固定不恰当探针丢失在塑料品上膜干了漂洗液没有稀释检查延长曝光时间用EtBr染色确证转膜用底物检测探针活性0.1X或增加温度增加探针浓度100°10分钟，骤冷5分钟检查均一性增加靶DNA/RNA浓度，转膜前充分变性靶DNA/RNA固定前用1XTE或水轻轻漂洗膜使用低吸收率的塑料始终保持湿润稀释到1倍第31页/共112页问题与对策四问题原因解决方法出现非特异性条带探针过量洗膜严谨度不够杂交温度不正确靶DNA/RNA降解或过量EtBr或胶污染妨碍杂交降低探针浓度0.1X或增加温度检查温度降低靶DNA/RNA浓度用1XTE或者0.1％SDS宽泛洗膜第32页/共112页Note5:中文说明书完整的中文说明书提供了需要的一切第33页/共112页2.2LightshiftTM化学发光EMSAPIERCE卓越的HRP/SuperSignal®化学发光检测系统与传统凝胶阻滞实验的完美结合0.5个工作日完成整个实验第34页/共112页用途检测蛋白质-核酸相互作用相互作用部位相互作用强弱鉴定调控序列第35页/共112页将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。TraditionalEMSA第36页/共112页LightshiftTM化学发光EMSA原理靶DNA探针上末端标记生物素探针末端的生物素与HRP上标记的亲和素结合化学发光底物与HRP反应DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢，在X光片呈现位置滞后，检测出DNA或RNA－蛋白质是否有相互作用第37页/共112页LightshiftTM化学发光EMSA特点安全：化学发光检测灵敏：亚飞克级，等同于同位素灵敏度稳定：生物素标记的探针可保存一年生物素末端标记，不影响相互作用快速：

从标记探针到EMSA结果分析只需一天的时间第38页/共112页操作流程核蛋白提取物与生物素标记的靶DNA或RNA孵育形成复合物电泳和转膜化学发光检测NE-PER®核蛋白提取物targetDNASuperSignal®+gel/transferBBBBdetection第39页/共112页操作时间第40页/共112页LightshiftEMSAKit与传统的地高辛，P32标记在灵敏性，曝光时间和信噪比的结果比较等同于同位素的灵敏度,同样曝光时间,是地高辛灵敏度的8倍第41页/共112页极高的信噪比和极短的曝光时间第42页/共112页完整Kit:100个反应800cm2的膜产品目录号名称包装20148LightShift®ChemiluminescentEMSAkitKit10XBindingBuffer1mlBiotin-EBNAControlDNA50µlUnlabeledEBNADNA50µlEBNAExtract125µlPoly(dI•dC)125µl50%Glycerol500µl1%NP-40500µl1MKCl1ml100mMMgCl2500µl200mMEDTA,pH8.0500µl5XLoadingBuffer1mlStabilizedStreptavidin-HorseradishPeroxidase750µlLuminol/EnhancerSolution80mlStablePeroxideSolution80mlBlockingBuffer500ml4XWashBuffer500mlSubstrateEquilibrationBuffer500ml89818生物素DNA3´末端标记试剂盒Kit78833NE-PER®核蛋白和胞质蛋白抽提试剂Kit77016Biodyne®B尼龙膜25/pkg.34090CL-XPosureTMX光胶片(5"x7")100张21065Erase-it®胶片背景消除剂kit89858EZ-Detect™NF-κBp50转录因子分析试剂盒2plates/kit89859EZ-Detect™NF-κBp65转录因子分析试剂盒2plates/kit89860EZ-Detectc-Fos转录因子分析试剂盒2plates/kit89861EZ-Detect™c-Jun转录因子分析试剂盒2plates/kit第43页/共112页抽提液的制备（核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解）结合蛋白的浓度探针的浓度非特异性探针的浓度缓冲液的配方和pH聚丙烯凝胶电泳条件保温时间和温度是否有辅助因子（比如锌，或镉等金属离子，或激素）反应总体积应最小（20ul）

成功进行凝胶迁移实验，需要优化哪些因素？第44页/共112页待检测蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核蛋白抽提液。纯化蛋白的量在20-2000ng间，可将蛋白：DNA的等摩尔比调整为蛋白的摩尔数是DNA的5倍。用粗制核抽提液，需要1-20ug蛋白以形成特异的复合物。用pierce78833，需要2－3ul。加入反应的探针的量是50fmole竞争实验中所用竞争DNA用量为4Pmole（200倍）反应体积为20ul。探针应保存在-20oC以防止降解，可长期保存蛋白质或抽提物以及标记DNA探针用量第45页/共112页

由肌苷和胞嘧啶组成。由于其特定的结构，可抑制蛋白对标记探针的非特异结合，避免假复合物。在凝胶迁移反应中加入poly(dI:dC))，可抑制粗制核抽提液中其它DNA结合蛋白结合，比如转录调节因子的非特异结合。当用纯化的蛋白作凝胶迁移反应时，不必一定加入poly(dI:dC)，如加入，则普通反应中所用终浓度不超过50-100ng。对核抽提液，每2-3ug核抽提液用1ugpoly(dI:dC)。非特异性探针poly(dI:dC)第46页/共112页非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离。浓度一般为6%，在特定条件下可调整聚丙烯酰胺的浓度。还可用高强度琼脂糖凝胶分离蛋白/探针复合物大多数蛋白用100-150伏左右的电压，解离快的蛋白用短时间和高的电压。电泳时所用的TBE和TAE必需是新配制的，无沉淀。也可将TGE缓冲液（12.5mMTris,pH8.3,95mM甘氨酸，0.5mMEDTA）用于不稳定的蛋白/DNA复合物。可在4oC进行结合和电泳实验以阻止不稳定复合物和探针的解离。加样样品液中的色素会导致不稳定复合物的解离，应用不含考马斯兰和二甲苯蓝的加样样品液。电泳条件第47页/共112页多个Shift：部分纯化的蛋白或粗制核抽提液和一个特定的探针可形成一个或几个特异的蛋白复合物。多个复合物的存在表明蛋白降解，应在制备抽提液的溶液中和结合反应中加入蛋白酶抑制剂。Supershift：使用目的蛋白抗体，进行超迁移实验。抗体可加入到蛋白和探针反应后，也可将抽提物与抗体结合后，再加入探针。取决于抗体的特定的抗原决定簇，前者有利于超迁移复合物地形成，后者阻止复合物的形成导致原复合物的强度减少。如何确定Shift第48页/共112页其它注意事项凝胶必需完全聚合，当带型不紧密出现拖尾时，表明复合物存在解离。以避免带型拖尾。上样：如复合物不进入凝胶则表明所用的蛋白或探针过量，或盐的浓度过量不适用于这一反应。探针降解：抽提物有核酸或磷酸酶污染，应在抽提液中和结合反应中加入相应的抑制剂。设对照紫外交联:254或312nm第49页/共112页Troubleshooting问题原因解决方案高背景1.在酶、缓冲液、或底物中有不溶颗粒2.TBE有污染3.器皿污染1.放到适当温度。离心或过滤去除颗粒。2.重新配制或过滤出现斑块/点1.HRP沉淀2.有气泡1.过滤2.转膜时消除无信号1.标记失败

2.靶DNA/RNA太少

3.靶DNA/RNA降解

4.转膜失败

5.错误膜

6.膜干了

7.交联不好

8.4X洗液没有稀释

9.曝光时间太短第50页/共112页问题原因解决方案无shift1.混合或加热使复合物解离2.蛋白抽提物不足3.抽提物降解4.系统没有优化1.冷缓冲液跑胶

2.增加粗提物用量

3.加蛋白酶抑制剂

4.优化KCI，甘油，NP40，Mg2+，Zn2＋所有DNA迁移到顶部没有加非特异性DNApoly(dI:dC)第51页/共112页3.WesternBlotting的问题与对策WesternBlotting方法选择检测系统比较检测方法影响Westernblotting成功的要素常见问题分析与对策第52页/共112页WesternBlotting方法一:直接法优点：

1.快速（一种抗体）

2.没有二抗交叉反应引起的非特异性条带

缺点：

1.免疫反应性降低

2.无信号二级放大

3.抗体标记费时昂贵,使用不方便第53页/共112页WesternBlotting方法二:间接法优点：

1.免疫特异性不受标记影响

2.信号放大,灵敏度高（多个二抗结合位点）

3.多种标记的二抗可供选择

4.可选择不同的Marker缺点：

1.交叉反应引起的非特异性条带

2.额外的二抗孵育以及条件优化第54页/共112页HRP（辣根过氧化酶)AP（碱性磷酸酶）大小40Kd140Kd最佳酶活性PH：5－7PH：8－10酶活和二抗特异性好于AP抑制剂氰化物，硫化物叠氮钠氰化物，砷酸盐，有机磷，二价阳离子螯合剂稳定性零度以下稳定零度以下不稳定底物很多部分动力学特性快速慢价格便宜昂贵发光底物Supersignal，ECLLumi-Phos显色底物TMB，CN，DABNBT，BCIP，NBT/BCIP两种常用检测酶系统的比较第55页/共112页检测方法化学显色法:方便、便宜、有毒、灵敏度较低、费抗体、反应慢、线性窄、不易保存、不能重新剥离检测化学发光法:灵敏、快速、节省抗体、反应快、线性宽、无害、特异性高、可重新剥离检测同位素法:灵敏度高、不安全、环境污染、不方便和半衰期短荧光底物法：Krypton™荧光底物第56页/共112页HRP,AP标记二抗与一抗－蛋白复合物结合漂洗和封闭YYHRPHRPHRPSuperSignal®

底物与二抗HRP,AP反应,显色或发光5SuperSignal®421电泳分离，转膜，固定蛋白于膜上3一抗与蛋白结合(小鼠单抗或兔多抗)间接WesternBlotting操作流程:第57页/共112页影响Westernblotting成功的要素电泳分离蛋白质：蛋白抽提，样品制备，电泳转膜：膜的选择，转膜确认，特殊处理封闭：封闭液选择，封闭条件优化漂洗：漂洗液的配制与选择抗体孵育：抗体选择，抗体稀释倍数优化，点杂交底物孵育：恰当的发光或显色底物曝光：曝光时间掌控，X-光片,信号增强剂后WesternBlotting选择：Striping抗体剥离bufferEraserit底片背景去除剂Qentix信号增强剂第58页/共112页第一步：电泳分离蛋白质蛋白抽提：材料，组分，量，降解样品制备：盐，不相容物质电泳：预制胶，上样缓冲液，转膜养成使用内参的实验习惯第59页/共112页建议一：蛋白抽提传统细胞裂解方法机械法匀浆破碎法研磨法超声破碎法反复冻融法问题容易引起蛋白质变性和聚集需要低温进行蛋白回收率低需要额外设备M-PER®培养细胞总蛋白提取试剂T-PER®动物组织总蛋白提取试剂B-PER®细菌总蛋白提取试剂Y-PER®酵母总蛋白提取试剂I-PER®昆虫细胞总蛋白提取试剂P-PER®植物细胞总蛋白提取试剂Mem-PER®真核膜蛋白提取KitNE-PER®胞质&核蛋白抽提试剂线粒体抽提Kit还有防止蛋白质降解的蛋白酶抑制剂第60页/共112页建议二：蛋白质定量：估计蛋白质丰度BCA准确灵敏：20－2000μg/ml；MicroBCA0.5-20μg/ml（Pro#：23235）变异系数远小于考玛斯亮蓝法快速：45分钟,比经典的Lowry法快4倍经济实用：试管或微孔板测定与离子型和非离子型去污剂相容与还原剂和金属离子等不相容：Commassie改良增强Kit优点1－2000ug灵敏度,125-1500ug/mL线性反应最好一种试剂，简单，快速相容性好：还原剂，盐和金属离子以及螯合剂变异性小于普通考染法Micro法(1-25ug/mL）试剂冷冻保存2年缺点非线性颜色反应去污剂干扰变异系数大于BCA第61页/共112页建议三：样品制备:去除小分子，确保电泳成功传统透析的瓶颈特殊预处理，让你饱受煎熬低回收率，让你暴跳如雷难于操作，特别是处理小量样品难上加难由于泄漏导致珍贵样品的丢失比比皆是长时间透析让你欲罢不能SnakeSkin®透析袋（15-100ml，无须预处理）Slide-A-Lyzer®微量透析管（10-100l）Slide-A-Lyzer®透析卡（0.1-0.5ml,0.5to3ml,mlto12ml,12mlto30ml）Microdialyzer微量透析系统第62页/共112页建议四：样品制备：去除盐等不相容物质，确保电泳成功脱盐用于蛋白质缓冲液置换去除核酸溶液中的酚去除未连接成功的交联剂标记蛋白时未标记的染料分子等去除探针标记时的同位素传统脱盐柱的所有瓶颈烦琐的重力分部收集受限的上样样品体积样品回收率低回收样品稀释操作费时费力，无法同时多样品并行处理新改良的脱盐方法：Zeba™离心式脱盐柱

截留范围<1000;样品>700095%的盐和分子量小于1000的分子储留能力易于使用，无需平衡和装柱，离心一步收集无需多步多组分收集，样品几乎没有稀释快速，少于6分钟同时多样品并行处理多种样品体积备选Zeba™微量离心式脱盐柱：

2–12µl样品Zeba™离心式脱盐柱：

30µl－4mL样品Zeba™96孔离心式脱盐板：

5分钟内并行高通量脱盐，20–100µl样品第63页/共112页建议五：样品制备:浓缩样品，增加上样量Slide-A-Lyzer®

蛋白质浓缩液原理：亲水的高分子聚合物，将样品中的水和小分子抽吸出来，达到浓缩目的特点：精制的高分子聚合物，去除了小分子物质，避免了污染80分钟内浓缩5－10倍与透析卡配合使用，效果更佳Pro#:66530;66528;66529

传统浓缩的瓶颈堵塞离心柱低回收率浓缩效果差长时间倒置离心iCON™蛋白质浓缩管30分钟内取得150-400倍的浓缩效果样品收集简单，且无需倒置离心大于90%的样品回收率

9K和20K两种截留选择样品范围从1-7毫升和5-20毫升适用于平转头和角转头Pro#:89884-89887第64页/共112页建议六：样品制备：净化与富集同步，确保条带清晰漂亮PAGEprep®蛋白质净化与富集Kit（Pro：89888）原理在DMSO存在下，蛋白质与修饰过的硅藻土胶结合，原缓冲液被离心洗去，上样缓冲液离心洗脱蛋白特点：无需透析即可高效去除染料、还原剂，去污剂、糖、甘油、尿素、硫酸铵和胍等与PAGE电泳不相容的杂质处理小至1ul样品10分钟内完成,可直接上样电泳样品浓缩10倍，20μl的胶可以与20μg以上的蛋白质结合，比常规透析法、超滤法高效，简单、快速第65页/共112页建议七：蛋白质电泳制胶Precise™

预制胶18个月的保质期和12个月的最佳使用期50-60分钟的跑胶时间(100–110V)90分钟转膜时间(ice,200mAor40V)与大多数电泳槽相容如上样buffer电泳条件染色Imperial™蛋白质超级染色试剂Highlights:即开即用，无须配制快速简单:1hrstain,1hrwash无须甲醇/乙酸脱色低背景高灵敏度：－3ng!与质谱分析或测序相容StainTimeSensitivityGelCode™蓝色染色试剂60min10-20ngImperial™

染色试剂60min3-10ngKrypton™

荧光染色试剂120min0.25ngSilverSNAP™

银染色试剂35min0.25ngColorSilver

染色试剂65min0.1ngE-Zinc

锌可逆染色试剂15min0.25ngGelCode™6xHis

组氨酸染色试剂90min200ngGelCode™磷酸化蛋白染色试剂180min200ngGelCode™糖蛋白质染色试剂120min200ng第66页/共112页第二步：转膜膜的选择：NC，PVDF，尼龙膜转膜确认特殊处理节省抗体：MiserTM抗体节约缓冲液增强信号：QentixTM信号增强剂代替转膜：胶上Westernblotting第67页/共112页建议一：转印膜选择第68页/共112页建议二MemCode™蛋白质可逆染色试剂25ng检测灵敏度，是丽春红的10倍染色不褪色，易于拍照成像与下游WB检测完全相容，无任何干扰染色30Sec；脱色10minPrestain™蛋白质预染Markers实时监测分子量参照灵敏度比较干扰性比较第69页/共112页建议三：直接在电泳胶上作WB可以用于转膜困难或者转膜不完全的蛋白质（蛋白质分子量、PI、缓冲液PH，甲醇，蛋白质疏水性）无需转膜或封闭与重新剥离抗体或重新检测相容性好1ng的检测灵敏度能用于其它ECL底物可用于10块迷你胶的检测Pro#：33500；33505；33510；33515；33550第70页/共112页建议四：MiserTM抗体节约缓冲液节约抗体可达1/3-1/100操作简单，仅需10分钟适用于发光、显色/HRP和AP检测适用于NC膜Pro#32110,32105使用更灵敏的底物第71页/共112页建议五：Qentix信号增强剂15分钟内使信号强度增强3-10倍；适用于化学发光，荧光和显色反应为原理的WB适用于NC，PVDF膜室温稳定储存，即开即用操作简单第72页/共112页第三步：封闭Pierce封闭液无生物素，无血清蛋白无交叉反应1－15分钟封闭时间10－20：1的信噪比，背景更干净封闭条件优化时间温度去污剂第73页/共112页建议：Pierce封闭液选择New!Protein-Free™BlockingBuffers(37570,37572)andProtein-Free™T20BlockingBuffers(37571,37573)contain0.05%Tween-20第74页/共112页第四步:漂洗第75页/共112页第五步：抗体孵育一抗和二抗的选择：一抗：特异性，灵敏度（单抗，多抗，片断）二抗：HRP活性，耦联效率，浓度HRP，AP，未标记，生物素，荧光素，罗丹明标记，F(ab)2通用”二抗：HRP标记蛋白A,G,A/G,L以及SA-HRP酶标二抗活性的保持

(1)ethyleneglycol：－20°可保存2年

(2)SuperFreez™HRP二抗稳定剂：1：1稀释－

20°可溶液保存1年

(3)Guardin™HRP二抗稳定/稀释保存剂1：1000或

1：100，000倍稀释，4°可保存1年，室温6个月稀释倍数优化（点杂交）第76页/共112页建议一：最佳抗体稀释倍数（点杂交）1.2－5ul不同稀释梯度的样品于

NC，自然干燥10－30min2.室温封闭1h3.加入一抗4.TBS或PBS洗膜4－6X5min5.加入二抗,室温孵育1h6.TBS或PBS洗膜4－6X5min7.底物孵育8cm2/mL8.曝光时间：30－60Sec第77页/共112页建议二：MiserTM抗体节约缓冲液节约抗体可达1/3-1/100操作简单，仅需10分钟适用于发光、显色/HRP和AP检测适用于NC膜Pro#32110,32105使用更灵敏的底物第78页/共112页第六步：底物孵育底物选择原则：样品丰度检测灵敏度抗体珍稀度经济成本实验条件方便否来选择最恰当的底物发光底物：HRP和AP底物系统显色底物：HRP和AP底物系统

第79页/共112页PierceWesternBlotting底物一览第80页/共112页SuperSignal®Western

化学发光底物WesternPico底物和KitPierceECLWesternDura增强底物和KitWesternFemto超高灵敏型底物KitLumiPhos碱性磷酸酶化学发光底物Twicetheflash.

HalftheCash第81页/共112页SuperSignal®化学发光底物发光原理和特点高灵敏度：比显色法高103-106倍多种灵敏度选择：10-12-10-15节约抗体:其它底物用量1/10－1/1000强信号，长发光，8－24小时底物稳定，常温保存检测快速：1-5分钟高特异性，高信/噪比检测方便：X光片或CCD检测多次曝光：选择满意的信号强度反复检测：用不同抗体，对同一蛋白的不同决定簇进行反复检测分析第82页/共112页SuperSignal®Pico化学发光底物—性价比最高的底物10-12检测灵敏度：要求较高抗体稀释倍数底物稳定性高：底物常温下稳定保存至少1年工作液常温下至少保持24小时发光持续时间长：8小时发光时间，可反复曝光更节约宝贵的抗体:一抗稀释倍数是1000－5000倍二抗稀释倍数是20000－100000倍与同类产品比，价格低注意：抗体的稀释倍数是由底物和待检测蛋白质的丰度决定的，为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行点杂交预实验，以确定具体的实验参数第83页/共112页SuperSignal®与ECL花费比较第84页/共112页如何选择合适的Pico底物或Kit底物（50ml，100ml，500ml，1L）标准检测Kit：500ml底物＋2ml山羊抗鼠，兔二抗完整检测Kit：500ml底物＋2ml山羊抗鼠＋兔二抗＋1L封闭液＋4包洗脱液第85页/共112页2.PierceECLWesternBlottingSubstrate同样的灵敏度，一半的价钱无须优化任何条件Pro#:32106(500mL);32209(250mL)；32109(50mL)New第86页/共112页3.SuperSignal®Dura-化学发光底物－发光时间最长的底物24小时发光时间：比任何其它改良的HRP化学发光底物要长10倍；10-14克级灵敏度节省抗体：抗体稀释度达一抗1000-50,000和二抗50,000-250,000倍，同样抗体可做25-50个WB立即产生强烈信号，特别适合CCD仪器检测工作液稳定24小时；常温保存一年第87页/共112页如何选择合适的Duro底物Kit底物Kit：20ml标准检测Kit：

100ml底物＋1ml山羊抗鼠＋1ml山羊抗兔二抗

200ml底物＋1ml山羊抗鼠＋1ml山羊抗兔二抗产品：37071；34075；34076第88页/共112页4.SuperSignal®Femto化学发光底物－最灵敏的化学发光底物最灵敏的化学发光底物：10-15克一抗稀释度：1/5000-100,000二抗1/100,000-500,000用于极端微量样品的检测抗体珍稀样品的检测稳定：4°一年，室温半年免费Pierce高质量二抗第89页/共112页如何选择合适的Femto底物Kit底物Kit：20ml标准检测Kit：

100ml底物＋1ml山羊抗鼠＋1ml山羊抗兔二抗

200ml底物＋1ml山羊抗鼠＋1ml山羊抗兔二抗、产品：34094；34095；34096；第90页/共112页5.碱性磷酸酶化学发光底物：Pro#:34150第91页/共112页6.PIERCEHRP化学显色底物第92页/共112页7.AP化学显色底物第93页/共112页底物与膜孵育X-光片曝光时间的掌握显影和定影液信号增强剂第七步：曝光第94页/共112页第95页/共112页特别推荐：不需反复作WB的选择一选择抗体剥离buffer无须反复电泳和转膜，节省宝贵时间节省珍贵的样品温和的无气味配方，对娇嫩的蛋白质丝毫无损一份样品，一次电泳，一次转膜，多次印迹，更多数据第96页/共112页不需反复作WB的选择二：X光片背景去除试剂

用于各种X光片的背景处理，例如常规的Western、Northern、Southern、EMSA等。特点/优点：去除不需要的背景，包括过度曝光、抗体浓度过高，封闭差，抗体/酶沉淀形成的高背景、阴影、杂点等不需要费时的重复曝光不需要重复优化各种实验参数浓缩液可制备3