生物技术制药抗体制药

生物技术制药抗体制药第1页/共65页第四章抗体制药第一节概述第二节单克隆抗体第三节基因工程抗体第四节抗体工程第五节抗体诊断试剂第六节抗体治疗药物第2页/共65页第一阶段：用抗原免疫动物来获得多克隆抗体。1890年Behring和北里柴三郎等发现了白喉抗毒素，并建立了血清疗法，开抗体制药之先河。第二阶段：1975年Köhler和Milstein等创建杂交瘤技术，制备单克隆抗体，以及各种改进型抗体，如人-鼠嵌合抗体。第三阶段：1994年Winter以基因工程方法制备抗体为代表，并发展为抗体工程。第3页/共65页1.抗原（antigen，Ag）：指能与淋巴细胞的抗原识别受体特异性结合，具有启动特异性免疫应答，而且能与应答产物（抗体或致敏淋巴细胞）在体内外发生特异性反应的物质。一、免疫学相关知识第一节概述异物性：是指抗原与所刺激机体的自身物质的差异，这是构成抗原免疫原性的首要条件。第4页/共65页抗原决定簇/基（antigendeterminant）

——抗原特异性的物质基础：抗原分子中决定抗原特异性的基本结构或化学基团。抗原分子表面的特殊化学基团，一般由5～15个氨基酸、5~7个多糖残基或核苷酸组成。抗原借其决定簇与相应的淋巴细胞表面的受体结合而激活淋巴细胞，引起免疫应答；抗原也依靠其决定簇与相应抗体及致敏淋巴细胞发生特异性结合。抗原的特异性（specificity）：是指抗原诱导机体产生应答及与应答产物发生反应均具有专一性。第5页/共65页2、抗体（antibody，Ab）是机体免疫系统受抗原刺激后产生的一类能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白。抗体由分化成熟的终末B细胞，即浆细胞所合成与分泌。免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）：是指具有抗体活性，或化学结构与抗体相似的球蛋白。主要存在于血液和其它分泌液中，包括抗体和骨髓瘤、巨球蛋白血症等病人血清中未证实抗体活性的异常免疫球蛋白。第6页/共65页抗体是免疫球蛋白，但免疫球蛋白不一定都是抗体。抗体是生物学功能的概念免疫球蛋白是化学结构的概念Ab=Ig，Ig≠Ab第7页/共65页Ig的基本结构：由四条肽链构成的单体，即由两条相同的重链（heavychain，H链）和两条相同的轻链（lightchain，L链）组成。借链间二硫键而彼此连接在一起，形成Y字形的Ig单体分子。Ig的功能区：借助链内二硫键的相互作用，将Ig的多肽链折叠成几个具有特殊生物学功能的球形结构，一般重链有4~5个、轻链有2个功能区

。包括（1）氨基酸组成和排列比较稳定，称为恒定区（constantregion，C区）。（2）氨基酸的种类、排列顺序与构型的变化很大，故称可变区。第8页/共65页超变区是Ig与抗原决定簇发生特异性结合的部位，故又称为互补决定区（complementarity-determiningregion，CDR）。在V区中，某些特定区域的氨基酸残基显示出更大的变异性，称为Ig的超变区。⑶超变区（hypervariableregion，HVR）

V区的其他部位称为骨架区（frameworkregions，FR），其结构相对稳定。第9页/共65页Heavychaing,a,m,d,oreLightchainkorl第10页/共65页

第11页/共65页第12页/共65页第13页/共65页第14页/共65页3.人工制备抗体多克隆抗体（polyclonalantibody，PcAb)：将抗原注入机体后，刺激B细胞产生的抗体是针对多种抗原决定簇的多种抗体的混合物。特异性不高，有交叉反应。单克隆抗体（monoclonalantibody，McAb）：针对一个抗原决定簇，由一个B细胞分化增殖的子代细胞克隆而产生的抗体，称为单克隆抗体。抗体出现的过程：抗原T细胞B细胞浆细胞抗体第15页/共65页毒性基团ABCD机体感染抗感染抗体抗A抗B抗C抗D无保护作用中和毒素抗感染作用无保护作用吸附感染基团第16页/共65页单克隆和多克隆抗体的比较保存的稳定性良好略差结合特性

与抗原上所有决定簇结合只与抗原上某一特定决定簇结合其他血清蛋白存在仅小牛血清少量存在无关的Ig10mg/mL原则上不存在0.5~1.0mg/mL抗体含量0.1~1.0mg/mL50~100mg/mL10~50mg/mL特异性和亲和性个体差异，的可重复性每批均不一样不变与其他抗原的交叉反应有无Ig的类和亚类所有类和亚类的混合物仅一种亚类McAb培养上清液小鼠腹水性状PcAb第17页/共65页①用于免疫学检测，辅助临床诊断。②McAb用于亲和层析，分离微量可溶性抗原。③标记的McAb用于基础研究，了解细胞分化等。④制备生物导弹用于肿瘤、移植等的临床治疗。单克隆抗体的用途第18页/共65页单克隆抗体的应用用于疾病的诊断和治疗：如利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，或用放射性核素标记单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免疫鉴定。用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。单克隆抗体还可作为载体制备导向药物。但是要解决以下两个问题：（1）鼠源性单克隆抗体的免疫原性；（2）完整的抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。第19页/共65页单克隆抗体的应用基因工程技术为解决这两个问题提供了可能。已通过基因工程技术，制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位。基本消除了单克隆抗体的鼠源性，相对分子质量只有完整抗体分子的1/80~1/3，而且鼠源性单克隆抗体的生物学活性如激活补体、促进吞噬功能（免疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等，只保留同抗原特异性结合的活性。第20页/共65页二、细胞融合技术背景知识1958年，冈田善雄发现紫外灭活得仙台病毒可引起艾式腹水瘤细胞融合。1964年，Little-field用A3-1细胞和B34细胞融合，并采用HAT培养基，将杂种细胞筛选出来。细胞融合技术（体细胞杂交）：将两个不同种类的细胞，用化学的、生物的或物理学的方法，使它们彼此融合在一起，从而产生出兼有两个亲本遗传性状的细胞，其实质是无性杂交。第21页/共65页第二节单克隆抗体单克隆抗体是将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而生产的。由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，因此称为单克隆抗体。它是结构和特异性完全相同的高纯度抗体。制备的一般流程见下图。第22页/共65页单克隆抗体和

多克隆抗体的制备抗原脾B淋巴细胞融合融合淋巴细胞骨髓瘤细胞克隆1克隆2克隆3克隆4第23页/共65页第二节单克隆抗体一、抗原与动物免疫二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养三、筛选阳性克隆与克隆化四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定五、单克隆抗体的大量制备六、单克隆抗体的纯化第24页/共65页一、抗原与动物免疫（1）制备用于动物免疫的适当抗原。化学合成抗原，如精制的地高辛。多数情况下抗原物质只能得到部分纯化，甚至是极不纯的混合物，如部分纯化的干扰素。通过克隆化选出最适当的单克隆抗体。在制备恶性肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体时，情况较复杂，需用整个肿瘤细胞做为免疫原，经过筛选、克隆化，制备出仅存在于肿瘤细胞而不存在于正常细胞上的表面标志分子上的单克隆抗体。第25页/共65页一、抗原与动物免疫（2）稳定的杂交瘤的获得因免疫动物品系和骨髓瘤细胞在种系发生上距离越远，产生的杂交瘤越不稳定，故一般采用与骨髓瘤供体同一品系的动物进行免疫。目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和Lou大鼠，因此免疫动物也多采用相应的品系，最常用的也是BALB/c小鼠。选择动物时应考虑到动物品系的免疫应答基因（Ir）对抗原免疫应答的影响。不同品系的小鼠与大鼠在对某类抗原的免疫应答上是不同的。书中表4-1是骨髓瘤细胞系一览表，可以参考。第26页/共65页一、抗原与动物免疫（3）免疫方法：体内免疫法和体外免疫法体内免疫法：适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用8~12周龄的雌性鼠。颗粒性抗原（如细菌、细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔107个细胞进行初次免疫，间隔1~3周，再追加免疫1~2次，可溶性抗原则按每只小鼠10~100g抗原与福氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔2~4周，再用不加佐剂的原抗原追加免疫1~2次。一般在采集脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原，其目的是使对应的B淋巴细胞克隆受到可靠的最大限度的刺激，使其迅速地增殖分裂，因为细胞融合后增殖最好的细胞是迅速分裂的细胞。有人认为在常规免疫的基础上用脾内免疫法做追加免疫较佳。第27页/共65页一、抗原与动物免疫（3）免疫方法：体内免疫法和体外免疫法体外免疫法：用于不能采用体内免疫法的情况下，如制备人源性单克隆抗体，或者抗原的免疫原性极弱且能引起免疫抑制时使用。体外免疫法所需要的抗原量少，一般只需几个g，免疫期短，仅4~5天，干扰因素少，已成功制备出针对多种抗原的单克隆抗体，但融合后产生的杂交瘤细胞株不够稳定。其基本方法是用4~8周龄BALB/c小鼠的脾脏制成单个细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达0.5~5g/ml，在5%CO2、37℃下培养4~5天，再分离脾脏细胞，进行细胞融合。第28页/共65页二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养（1）细胞融合基本方法：取适量脾细胞（1×108）与骨髓瘤细胞（2×107~3×107）进行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。（2）用于融合的骨髓瘤细胞应具备条件：融合率高，自身不分泌抗体，所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定等特点。书中表4-1列举了主要的骨髓瘤细胞系，其中SP2/0、P3.653细胞本身不分泌抗体，细胞融合后产生的杂交瘤细胞只分泌均一的、完全来自脾细胞的抗体分子，它们是目前较为理想的可供融合的骨髓瘤细胞。特别是SP2/0细胞系还具有容易培养、融合率高等特点，被国内外多个实验室广泛采用。第29页/共65页二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养（3）诱导剂PEG的影响：PEG分子量以及浓度越大，促融率越高。但其粘度和对细胞的毒性也随之增大。目前常用的PEG的浓度为40%~50%，相对分子质量以4000为佳。但相对分子量400~6000，浓度在10%~50%范围之间的PEG都能使细胞融合。为了提高融合率，在PEG溶液中加入二甲基亚砜(DMSO），以提高细胞接触的紧密性，增加融合率。但是，PEG和DMSO都对细胞有毒性，必须严格限制它们和细胞的接触时间，可通过低速离心5min使细胞接触更为紧密，然后用新配制的培养液来稀释药物并洗涤细胞。第30页/共65页二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养（4）培养基的正确选择：常用的选择培养基为HAT培养基。

HAT系次黄嘌呤（hypoxantin）、氨基蝶呤（aminopterin）和胸腺嘧啶脱氧核苷（thymidin）三种物质各英文首字之缀列，HAT培养基也就是指含有这三种物质的细胞培养基。对具有合成DNA原料的核苷酸的形成上，在细胞内具有起始合成途径（denovopathway）和中间合成途径（salvagepa-thway）。由于氨基蝶呤可阻碍起始合成途径，所以培养基中含有它时，细胞便只有中间合成途径，所以必须供给核苷酸。至于缺失中间合成途径的细胞，可失去增殖能力臻于死亡。第31页/共65页杂交后存在脾细胞、脾-脾融合细胞、瘤细胞、瘤-瘤融合细胞和脾-瘤融合细胞。根据这一点，可将混存于细胞群中的正常细胞，通过试管内培养进行选择。脾-脾融合细胞和瘤细胞在这样的条件下，几天内迅速死亡。此外，由于SP2/0等骨髓瘤细胞都是次黄嘌呤（H）鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT）缺乏株，瘤-瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾细胞中存在HGPRT酶，因此脾-瘤融合的杂交瘤细胞可利用HGPRT酶，用次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶（T）合成DNA，使杂交瘤细胞得以生长。次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷可作为中间合成途径的原料而进行添加。第32页/共65页二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养（5）选择性培养方法：通常将融合的细胞悬浮于HAT的培养液（配方见书中表4-2），加入到含有饲养细胞的96孔板内，根据情况每2~3天换液一次。换液时吸去1/2~2/3培养液，加入等量的新鲜培养液。在融合后7天内用HAT培养液，杀死瘤-瘤融合细胞后，第7~14天改用HT培养液，14天以后用普通的RPMI1640 完全培养液（配方书中表4-3），从融合后8~9天就可对所有克隆生长孔的培养上清进行抗体检测，筛选出产生抗体的阳性克隆。第33页/共65页二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养（6）饲养细胞：由于在最适的条件下大约有105个脾细胞才能形成一个杂交瘤细胞，大量瘤细胞在HAT培养液中相继死亡，单个或少数的杂交瘤细胞多半不能存活，所以通常要加入饲养细胞才能使其繁殖。常用的饲养细胞有小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞等。一般认为饲养细胞能释放某些生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞，故应用的较多。第34页/共65页三、筛选阳性克隆与克隆化（1）筛选阳性克隆：因为产生特定抗原的抗体产生细胞只占所有脾细胞的5%左右，所以要进行每孔培养上清的抗体活性的筛选工作，以选择出阳性克隆，然后进行克隆化培养。为了尽快地筛选出阳性克隆，必须采用微量、快速、特异、敏感、简便并一次能检测大批标本的方法。常用的检测方法有免疫酶技术、免疫荧光技术和放射免疫技术等。一般来说，免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可溶性抗原及颗粒性抗原的抗体检测。免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测，特别是制备以检测患者活检组织标本为目的的抗体时，免疫荧光法更有意义，在筛选抗体的同时，还能对所识别的抗原进行定位判定。第35页/共65页1、精制破伤风毒素抗原（）吸附（约10g/ml，4℃，3h）洗涤2、加杂交瘤培养上清液（）（4℃，1h）3、加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（）（4℃，1h）洗涤洗涤4、加酶作用底物，呈色孔为阳性克隆孔ELISA用于破伤风抗体的筛选第36页/共65页三、筛选阳性克隆与克隆化（2）克隆化——有限稀释法和软琼脂法筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌抗体的细胞或有多株分泌抗体的细胞，而且刚刚融合获得的杂交瘤细胞不稳定，染色体容易丢失，因此应尽早克隆化。一般融合后获得的杂交瘤细胞要经过大约3次的克隆化，才能达到100%孔内均为抗体阳性细胞克隆。常用的克隆化方法有有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法是把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔细胞培养板中，使每个孔中在理论上只含有一个细胞。第一次克隆化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培养液。由于单个细胞难以存活，克隆化时也需加入饲养细胞辅助其生长。第37页/共65页三、筛选阳性克隆与克隆化（2）克隆化——有限稀释法和软琼脂法软琼脂法是在培养液中加入0.5%左右的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块，由于培养基是半固体状态，可用毛细吸管将小球吸出，团块打碎后，移入96孔板中继续培养。用这种方法可以吸出大量克隆细胞进行培养，因初代细胞很不易增殖，所以用软琼脂法进行克隆化容易成功。第38页/共65页四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定（1）杂交瘤细胞的鉴定正常鼠的脾细胞染色体数为40，全部是端着丝粒染色体。小鼠骨髓瘤细胞的染色体数变异较大，SP2/0细胞为62~68，NS-1细胞为54~64，大多数为非整倍性，并且有中部着丝点染色体和亚中部着丝点染色体。杂交瘤细胞的染色体在数目上接近两种亲本细胞染色体数目的总和，在结构上除多数为端着丝粒染色体外，还应出现少数标志染色体。染色体数目较多又比较集中的杂交瘤细胞能稳定分泌高效价的抗体，而染色体数目少且比较分散的杂交瘤细胞分泌抗体的能力较低。第39页/共65页四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定（2）抗体性状的鉴定由于不同类和不同亚类的免疫球蛋白生物学特性差异较大，诸如补体活化、免疫调理、ADCC效应等等，因此要对制备的杂交瘤细胞产生的单克隆抗体，进行Ig类和亚类的鉴定，可用羊或兔抗Ig不同类和亚类的抗体，进行免疫扩散或ELISA法来鉴定。在单克隆抗体鉴定中还必须进行亲和力测定，它可为正确选择不同用途的单克隆抗体提供依据。另外根据需要不同，还应对单克隆抗体的特异性、纯度和识别抗原的相对分子量等进行测定。第40页/共65页五、单克隆抗体的大量制备（1）体外培养法可获得10g/ml的抗体；（2）动物体内诱生法，可获得5~20mg/ml的抗体。目前多采用后者生产制备单克隆抗体。因为杂交瘤细胞的两种亲本细胞均来自BALB/c小鼠，所以应选用BALB/c小鼠来制备单克隆抗体。为了使杂交瘤细胞在腹腔内增殖良好，可于注入细胞的几周前，预先将具有刺激性的有机溶剂降植烷（pristane）注入腹腔内，以破坏腹腔内膜，建立杂交瘤易于增殖的环境。动物体内诱生法操作简便，也比较经济，所得单克隆抗体量较多且效价亦高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株，缺点是小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。第41页/共65页五、单克隆抗体的大量制备书中介绍了体外培养法和动物体内诱生法的具体步骤以及其它一些近来发展的方法。这里不一一介绍。利用悬浮培养方式可增加细胞生长空间，杂交瘤细胞生长旺盛，单克隆抗体产量得到提高。连续悬浮培养的细胞密度可达2.0107细胞/ml，收集的单克隆抗体可达到400g/ml左右。如在培养液中加入固体颗粒作为细胞生长的载体，增大单位体积的表面积，利于杂交瘤细胞生长，细胞密度可达108细胞/ml。并能收获更多的单抗。此称为微载体悬浮培养法，固体颗粒用DEAE-SephadexA50等材料制成。第42页/共65页六、单克隆抗体的纯化动物体内诱生法制备单克隆抗体具体方法及过程1、澄清和沉淀处理小鼠腹水中含有红细胞、细胞碎块、纤维蛋白凝块及脂质等，应首先用离心力1000g离心5min，去除残留的小颗粒物质；再用0.2m的微孔滤膜过滤，除掉污染的细菌、支原体和脂质；用饱和硫酸铵沉淀抗体，50%饱和硫酸铵能回收90%以上的单克隆抗体。2、分离根据用途可选用不同的方法，主要分离方法有凝胶过滤、阴离子交换层析、亲和层析等。第43页/共65页六、单克隆抗体的纯化2、分离（1）凝胶过滤用于IgG和IgM类单克隆抗体的分离纯化。常用SephadexG200作分离介质，可收集到三个峰，最高峰为IgM，另两个峰为IgG，抗体回收率达50%~80%，能去除污染的微量杂蛋白，抗体纯度可达95%以上。（2）阴离子交换层析用于IgG类单克隆抗体的分离纯化。在pH7.4条件下，IgG1和IgG2能结合在DEAE填料上，其中IgG2a可在较低离子强度条件下洗脱下来，其纯度较高。IgG2b、IgG3在低离子强度下易发生沉淀，可增加离子强度以提高产量，但其纯度相对较低。在pH5.5条件下，把杂交瘤细胞培养的上清液加到琼脂糖柱上时，所有的抗体都能结合到柱上，而55%的杂蛋白可被洗脱掉，再用不同离子强度的洗脱剂洗下。第44页/共65页续（2）离子交换法在最适离子强度及pH条件下，以离子交换层析分离单克隆抗体可以纯化25~100倍。高容量、高流速、化学稳定的新型离子交换剂适宜单克隆抗体的大规模纯化。（3）亲和层析多用蛋白A亲和层析，适用于IgG类单克隆抗体的纯化。IgG与蛋白A的结合与pH有密切关系，鼠源性单克隆抗体在pH8.0时，IgG2b、IgG3几乎全部结合于蛋白A柱上，IgG1稍差，用pH3.5缓冲液可洗脱IgG2b，pH4.0缓冲液可洗脱下IgG3，pH4.5缓冲液可洗脱下IgG2a，pH6.0可洗脱下IgG1。用蛋白A亲和层析收获的抗体纯度很高，但也有极微量的杂蛋白。第45页/共65页保留抗体的抗原结合能力、降低生产成本、易于大规模生产、减小鼠源性成份。⑵基本原理⑴目的借助基因工程手段，将编码Ab的基因重组到真核或原核表达载体上并进行表达。⑶种类人-鼠嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、双特异性抗体。第三节基因工程抗体第46页/共65页一、鼠源性单克隆抗体的改造改造鼠源性单克隆抗体的目的：一是降低免疫原性；二是降低相对分子量，增加组织通透性。对鼠源性抗体的改造已有很多成果报道，给出了改造后的单抗的类型和特性：第47页/共65页一、人-鼠嵌合抗体取鼠MAb基因的V区，与人Ig基因的C区拼接，然后插入表达质粒中，转染骨髓瘤细胞即产生鼠-人嵌合抗体，由于Ig的C区是人源的，所以这种抗体对人的免疫性就大为降低。第48页/共65页制备方法：（1）提取杂交瘤细胞系的mRNA，经过逆转录成cDNA，并以其为模板，采用特异引物，用PCR方法分别扩增VL和VH基因；（2）再分别连接真核表达所需的上游启动子、前导肽序列和下游剪切供体信号、增强子真核调控序列后，（3）将VL基因克隆到人Ig的CL基因表达载体上，将VH基因克隆到人IgG1的C基因真核表达载体上，（4）将人-鼠嵌合的V-C区基因质粒DNA等量混合，在脂质体介导下共转染骨髓瘤细胞SP2/0，（5）转染后用含霉酚酸进行筛选，形成集落的细胞即为共转染细胞，所分泌的抗体为嵌合抗体。它保持鼠源性单克隆抗体的抗原结合的特异性，但对人的免疫原性大幅下降了。如若用人IgG1或IgG3的C基因替换鼠IgG1或IgG2b，则可有效地加强多肽的ADCC效应与免疫调理作用。第49页/共65页二、改形抗体Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补性决定区（CDR区），而不是整个可变区。H和L链各有三个CDR，其他部分称为框架区。如果用鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。抗体分子中鼠源性部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。这种改形抗体（reshapingantibody）又称CDR移植抗体（CDRgraftingantibody）。第50页/共65页三、小分子抗体基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段，其相对分子量仅为原抗体的1/80~1/3。也就是说，保留了CDR区，而Ig分子的C区不表达。现在研制的小分子抗体有以下几种类型：（1）Fab抗体，由完整的轻链和重链（VH和CH1）所组成。（2）FV抗体，由VH和VL组成，天然FV片段中VH和VL为非共价性结合。（3）单链抗体（singlechainantibodySCA或singlechainFV,SCFV），由VH和VL通过一段连接肽（linker）连接而成的重组蛋白。有分子量小、穿透力强、免疫原性小特点，可与效应分子相连接构建新功能抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体的理想元件。（4）单域抗体，由VH(VL)单个可变区组成的，只有抗体分子的1/12，而且表面疏水性强，与抗原非特异结合能力也强。（5）最小识别单位（MRU）是由单个CDR区构成的小分子抗体，亲和力较低。第51页/共65页四、双功能抗体双功能抗体就是双特异性抗体（biospecificantibody,BsAb）。它是一种非天然性的抗体，其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。1、化学交联法2、生物学方法（杂种-杂交瘤）杂交瘤细胞与脾细胞融合得到可分泌两种亲代抗体和杂种抗体的杂种-杂交瘤细胞。3、基因工程方法采用适当的接头连接不同抗体的VH和VL区，使它们不能形成链内的分子内配对，让其形成原抗体的分子内配对，构建双特异性（SCFV)2。第52页/共65页五、抗体融合蛋白类型有：（1）配基-配基型融合蛋白，如CD4-Fc。（2）配基-Ig嵌合型蛋白，如IL-2-Ig。（3）配基-FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3。（40受体-FV型融合蛋白。（5）酶-抗体型融合蛋白。其中较为成熟的是配基-Ig型嵌合蛋白，而酶-抗体型融合蛋白（即抗体酶，abeneyme）在药物治疗中应用前景广阔，它可在靶向位置上将前体药物转化成有效的药物，避免对正常组织的伤害，此法称为抗体介导的酶前体药物治疗。第53页/共65页五、抗体融合蛋白构建抗体融合蛋白的原则是：将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个基因共表达。在抗体的N端和C端融合其它蛋白都可以获得成功。关键是两个蛋白间的接头序列linker，一般说来3~5个氨基酸就可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。如加入一段有疏水性和一定伸展性的长链，可缓解两种蛋白的相互干扰。第54页/共65页第四节抗体工程一、噬菌体抗体库技术的基本方法1、获得目的基因2、抗体库技术的载体：现在普遍使用噬菌粒（phagemid）载体，其中的pHEN1为新一代载体，转化效率高，有利于提高库容量。3、淘筛：抗原固定化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量扩增。四、表达与鉴定：目的克隆