生物学分子生物学DNA复制

生物学分子生物学DNA复制第1页/共122页主要内容第1节

DNA复制概述第2节细菌DNA的复制第3节真核生物DNA的复制第2页/共122页问题复制开始时亲本链是完全解开的吗？复制可以随机起始吗？复制是沿一个方向还是双向进行？复制是从5´→3´还是3´→

5，或是双向进行的？复制过程中有哪些酶参与？

第3页/共122页DNAreplication第1节

DNA复制概述一、半保留机制二、复制子(Replicons)和复制方向三、半不连续复制(semi-discontinousreplication

)四、RNA引导(RNApriming

)第4页/共122页一、半保留机制1.DNA复制:亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以各单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP，合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。

第5页/共122页一、半保留机制2.半保留复制：复制过程中各以双螺旋DNA的其中一条链为模板合成其互补链，新生的互补链与母链构成子代DNA分子。第6页/共122页亲代DNA子代子代半保留复制新合成的链第7页/共122页第8页/共122页2、实验证据（1958Meselson和Stahl）

MatthewMesselson

FranklinStahl第9页/共122页单林娜制作10

DNAreplication

E.ColiDNA在15N-标记的营养液中生长多代，使DNA双链充分标记万有引力将15N-标记的E.Coli

加入14N培养液中细胞在14N中复制1次细胞在14N中复制第2次细胞在14N中复制第3次第10页/共122页DNA半保留复制的生物学意义：

DNA的半保留复制表明DNA在代谢上的稳定性，保证亲代的遗传信息稳定地传递给后代。第11页/共122页复制子(复制单位或复制元

)

：能独立进行复制的DNA单位，从起始位点到终止位点的全部DNA。Origin(复制起始位点):复制开始处DNA分子的特定位置。(富含AT)Terminus(复制终止点)

复制终止处DNA分子的特定位置。DNAreplication二、复制子(Replicons)和复制方向1.复制子第12页/共122页原核生物（Prokaryote）：单复制起点，即——整个染色体只有一个复制单位第13页/共122页单林娜制作14

AllprokaryoticchromosomesandmanybacteriophageandviralDNAmoleculesarecirclesandcomprise

singlereplications.

（单复制子）第14页/共122页真核生物（Eukaryote）:多复制起点，即－－一个genome中有多个复制单位第15页/共122页2、复制方向（复制过程的顺序性）复制叉（Replicationfork）：复制时DNA分子中的叉形结构，是由解开的两条链和尚未松解开的双螺旋形成的，是复制有关的酶和蛋白质组装成复合物和新链合成的部位。replicationbubbles(复制泡)：两个靠得很近的复制叉之间形成的空间。第16页/共122页Replicationfork第17页/共122页originsofDNAreplication(every~150kb)replicationbubbledaughterchromosomesfusionofbubblesbidirectionalreplicationOriginsofDNAreplicationonmammalianchromosomes5’3’

3’5’

5’3’3’5’

3’5’

5’3’

第18页/共122页ElectronMicroscopyofreplicatingDNArevealsreplicatingbubbles.第19页/共122页

单向复制

双向复制

（1）单双向复制取决于起点处有一个还是两个复制叉第20页/共122页单起点、单方向（原核）多起点、单方向（真核）单起点、双方向(原核)多起点、双方向（真核）（2）复制的多模式第21页/共122页Bidirectional(双向复制)

replicationofacircularbacterialrepliconorignterminidaughterDNAAsingleterminationsiteisroughly180ooppositetheuniqueorigin第22页/共122页3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘三、半不连续复制(semi-discontinousreplication

)DNA聚合酶只能以5'→3'方向合成DNA，事实上没有发现DNA能按3‘→5’合成的证据第23页/共122页E.coli[t-]2’’,7’’,15’’,30’’

脉冲标记dT-H3

0℃KCN杀死D.S.DNAS.S.DNA密度梯度离心测定H3-T放射强度脉冲追踪20℃indT-H330’’正常培养基中数分钟

冈崎片段（Okazakifragment）1968

D.S.DNA第24页/共122页5’5’3’3’5’5’3’3’5’5’3’3’

前导链后随链Okazakifragment半不连续复制第25页/共122页leadingstrand（前导链）：DNA复制时，一股以3’5’方向的母链作为模板，指导新合成的链以5’3’方向连续合成的链称为前导链。（复制方向与解链方向一致）

第26页/共122页laggingstrand（后随链):

DNA复制时，一股以5’3’方向的母链作为模板，指导新合成的链沿5’3’合成1000—2000(100-200)个核苷酸不连续的小片段的链称为随从链。（复制方向与解链方向相反)第27页/共122页岗崎片段（Okazaki）：

DNA复制时，一股以5’3’方向的母链作为模板，指导新合成的链沿5’3’合成1000—2000(100-200)个核苷酸不连续的小片段称之为岗崎片段。岗崎片段由DNA连接酶连成一条完整的新链。

第28页/共122页

半不连续复制：

在DNA复制过程中，亲代DNA分子中以3’5’方向的母链作为模板指导新的链以5’3’

方向连续合成，另一股以5’3’

为方向的母链则指导新合成的链以5’3’方向合成许多不连续的片段（岗崎片段）这种复制方式称之为半不连续复制。第29页/共122页单林娜制作30

第30页/共122页DNAreplication四、RNA引导Thefirstfewnucleotides(核苷酸)atthe5’-endofOkazakifragmentsareribonucleotides(核糖核苷酸).Hence,DNAsynthesisisprimedbyRNAthatisthenremovedbeforefragmentsarejoined.

Crucialforhighfidelity(忠实性)ofreplication第31页/共122页5’5’3’3’5’5’3’3’

前导链随从链岗崎片段RNA引物3’-OH第32页/共122页DNA复制反应的共同特点半保留复制半不连续复制有特定的复制起点需要引物复制真实性复制叉双向移动，DNA合成的单向延伸，

5’3’

复制受控制第33页/共122页DNAreplication第2节细菌DNA的复制一、DNA复制所需的蛋白质和酶二、DNA复制的过程三、

DNA复制的方式第34页/共122页一、DNA复制所需的蛋白质和酶1.DNA链合成的条件底物:dATP,dGTP,dCTP,dTTPMg++3’-OHprimer

DNAtemplateProteinsandenzymes第35页/共122页第36页/共122页2.DNA复制所需的蛋白质和酶DNAhelicase(DNA解旋酶)single-strandedbindingprotein(SSB,单链结合蛋白)DNAprimase(DNA引发酶)DNAtopoisomerase(拓扑异构酶)Primosome(引发体)DNApolymerase(DNA聚合酶)DNAligase(DNA连接酶)第37页/共122页DNAhelicase(DNA解旋酶)

利用ATP供能，解开DNA双链,可随复制叉的伸展向前移动第38页/共122页大肠杆菌中解旋酶的种类种类功能DnaA辨认起始点，并结合到复制起始部位DnaB解开DNA双链DnaC运送和协同DnaB第39页/共122页single-strandedbindingprotein(SSB,单链结合蛋白)

稳定已被解开的DNA单链，阻止复性和保护单链不被核酸酶降解。使单链DNA呈伸展状态，无弯曲和结节，有利于作为模板第40页/共122页DNAprimase(DNA引发酶)

在模板复制的起始部位，以DNA为模板催化互补碱基聚合生成一小段RNAe.g.DNaG(E.coli)第41页/共122页DNAtopoisomerase(拓扑异构酶)

是一类调节DNA分子的超螺旋水平，可改变DNA拓扑性质的酶。对DNA分子的作用是既能水解、又能连接磷酸二酯键。拓扑异构酶I:切开DNA双链中的一股，使DNA在解链旋转中不打结，DNA变为松弛状态再封闭切口。同转录有关拓扑异构酶II:能切断DNA双链，使螺旋松弛。在ATP参与下，松弛的DNA进入负超螺旋，再连接断端。同复制有关第42页/共122页第43页/共122页

第44页/共122页Primosome(引发体)Amobilecomplexincludeshelicase(DNaA,DNaB,DNaC)andDNAprimase.

由多种蛋白质及酶组成,是DNA复制开始所必需的.

第45页/共122页第46页/共122页性质聚合酶Ⅰ聚合酶Ⅱ聚合酶Ⅲ3'5'外切活性+++5'3'外切活性+--5'3'聚合活性+中+很低+很高新生链合成--+主要是对DNA损伤的修复；以及在DNA复制时切除RNA引物并填补其留下的空隙。修复紫外光引起的DNA损伤DNA复制的主要聚合酶，还具有3’-5‘

外切酶的校对功能，提高DNA复制的保真性DNApolymerase(DNA聚合酶)第47页/共122页DNApolymeraseIIIDNApolymeraseIII二聚体复合物由10种亚基(αβγδδ′εθτχψ)组成不对称异源二聚体。–核心酶（αεθ）第48页/共122页DNApolymeraseIIIholoenzyme第49页/共122页DNApolⅢ各亚基的功能α亚基：5′→3′聚合酶活性β亚基：夹稳模板链并使酶沿模板链滑动γ－复合物（γ、δ、δ’、χ、ψ、τ）：促进全酶组装至模板及增强核心酶活性ε亚基：3′→5′外切酶活性和碱基选择功能，是复制保真性所必需θ亚基:

可能起组装作用

第50页/共122页单林娜制作51

第51页/共122页

3’5’

5’3’

exonuclease

polymeraseNC5’3’exonuclease小片段大片段（klenow片段）切除RNA引物损伤修复校读功能（常用的工具酶）DNAPolymeraseⅠ聚合功能第52页/共122页

2.核酸外切酶活性3´→5´外切酶活性：切除错配的核苷酸5´→3´外切酶活性：切除引物切除突变的片段？第53页/共122页

DNAligase

连接DNA链3-OH末端和相邻DNA链5-P末端，形成磷酸二酯键，从而把两段相邻的DNA链连接成完整的链。反应需要ATP。ATP第54页/共122页二、DNA复制的过程(1)Initiation(起始)(2)Elongation(延伸)(3)Terminationandsegregation(终止与分离)第55页/共122页(1)Initiation(起始)识别原点分开双链，稳定单链通过引发体起动子代链的合成反应第56页/共122页ThestructureofE.ColioriginoriC第57页/共122页单林娜制作58

只有完全甲基化的起点能够起始复制，半甲基化的起点在其完全恢复甲基化状态之前不能起始复制。第58页/共122页单林娜制作HUATP·DnaA

13bpsegments

OriC

Supercolledtemplate

1

单林娜制作59

1.起始复合体：随同HU蛋白一起，20~40个dnaAprotein-ATP复合体结合到DNA上，包围4个9-mers区HUATP·DnaA

13bpsegments

OriC

Supercolledtemplate

1

第59页/共122页单林娜制作2.开放性复合体：DnaA蛋白使13bp重复单位熔解而形成开放性复合体，这一过程需要ATP。3.前引发复合体：这时DnaB和DnaC蛋白进入DNA的熔解区与OriC结合形成前引发复合体。

4.单链结合蛋白结合，稳定OriC的单链结构引发和复制2

DnaBDnaCATP

DnaC

DnaB

3

4

38°

第60页/共122页4.引发体的组装解旋酶(DnaB)解开DNA链。SSB结合稳定其单链结构旋转酶解除链的张力引物酶(DnaG)结合到dnaBprotein上，形成

引发体.Primase引物酶

合成一段RNA引物第61页/共122页

DnaA

DnaB、DnaCDNAtopoisomerase引物酶SSB3535Prismosomeandprimer第62页/共122页3535引物是由引物酶催化合成的短链RNA分子。

引物3'HO5'引物酶第63页/共122页Re-initiation

ofbacterialreplicationatneworiginsbeforecompletionofthefirstroundofreplication第64页/共122页(3)Elongation(延伸)DNA聚合酶III合成前导链和滞后链DNApolymeraseI切除RNA引物，补齐空缺的碱基DNAligase连接冈崎片段.第65页/共122页

5'3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol第66页/共122页Leadingstrandelongation第67页/共122页回环模型：后随链模板绕聚合酶形成180。的回环，穿过DNA聚合酶III的裂缝，使两条模板链在此处呈相同的3′→5′方向。随着后随链模板在聚合酶中穿行，聚合酶便从引物3′端合成冈崎片段。第68页/共122页阶段一阶段二形成回环，与聚合酶的一个亚单位和引发体结合，准备开始合成引物引物行进5′→3′方向的合成，与复制叉行进的方向一致第69页/共122页阶段三阶段四环不断扩大，在引物3′-OH端开始合成DNA片段，合成方向为5′→3′当DNA新片段合成到距离前一片段的5′端仅剩一小空隙是，解环，新合成的片段移到与复制叉行进相反的方向。第70页/共122页Elongation:laggingstrandreplication

PolymeraseIIIholoenzyme(DNApolIII)DNApolI(5’3’exonulcleaseactivity)DNApolI(5’3’polymeraseactivity)DNAligase第71页/共122页3’5’5’3’第72页/共122页单林娜制作73

4-14随从链拓扑旋转酶解旋酶引发体冈崎片段引物PolⅢ前导链

SSBPolⅠDNA连接酶第73页/共122页(4)Terminationandsegregation(终止与分离)Termination(终止)Terminus(终止位点):containingseveralterminatorsites(ter)approximately180ooppositeoirC.第74页/共122页单林娜制作75

TerminationofE.coliDNAreplicationtrap顺时针复制叉反时针复制叉陷阱

第75页/共122页

在大肠杆菌和枯草杆菌中，在OriC中形成的两个复制叉沿环状染色体双向移动，最后在与oriC相对的复制终止子ter终止。有6个复制终止位点。3个终止顺时针方向延伸的复制叉，3个终止反时针方向延伸的复制叉。Ter序列为22-23bp,共有序列为

AAAAANNGTGTTGTAACTANNNTTTGC第76页/共122页Tusprotein:终止位点结合蛋白,是DnaB解旋酶的抑制剂

第77页/共122页(4)Terminationandsegregation(终止与分离)Segregation(分离)

拓扑异构酶IV:atypeIIDNAtopoisomerase,分开连锁的姐妹染色体第78页/共122页第79页/共122页单林娜制作80

相连的染色体第80页/共122页第81页/共122页4.DNA复制的方式(1)θ型复制(2)滚环复制(3)D环复制第82页/共122页双链环状、θ型复制、双向等速第83页/共122页滚环复制模型1968年Gilbert提出：模板链和新合成的链分开;不需RNA引物，在正链3‘－OH上延伸只有一个复制叉;单向复制的特殊方式第84页/共122页复制过程首先(+)链DNA复制起点被特异性蛋白切开，形成缺口，使游离出5′和3’-OH，(+)链的5′端与双链脱离开以(－)链DNA为模板，(+)链的3’-OH为引物，由DNA聚合酶III催化聚合反应，使链不断的延长，3’端不断延伸，取代原有的(+)链，被取代的(+)链不断剥离出来(+)链不断被合成，好像(－)链在滚动，(+)链5’形成越来越常的“尾巴”当置换出的正链DNA达到单位长度时被内切核酸酶酶切离后，环化为环形DNA。第85页/共122页第86页/共122页D环复制又称取代环复制。双链在固定点解开进行复制，但两条链的合成高度不对称，一条链先复制，另一条链保持单链而被取代在电镜下看到呈D环形状。原因：两条链的起点并不在同一点上，分开一段距离。第87页/共122页第88页/共122页第三节真核生物DNA的复制一、DNA复制所需的蛋白质和酶二、DNA复制的过程三、端粒DNA复制第89页/共122页一、DNA复制所需的蛋白质和酶DNAhelicase(DNA解旋酶)single-strandedbindingprotein(单链结合蛋白)replicationproteinA(RPA)DNAprimase(DNA引发酶)DNApolymerase(DNA聚合酶)辅因子DNAligase(DNA连接酶)第90页/共122页DNApolymerase(DNA聚合酶)DNApolymeraseαβγδεLocation位置nuclear细胞核nuclear细胞核mitochondrion线粒体nuclearnuclearActivity活性5’→3’的聚合酶活性;引物酶活性

5’→3’的聚合酶活性5’→3’的聚合酶活性；3’→5’的外切活性5’→3’的聚合酶活性；3’→5’的外切活性,需要PCNA5’→3’的聚合酶活性；3’→5’的外切活性Function功能引发Repair修复mDNAreplication前导链和后随链的合成Repair修复PCNA:增殖细胞核抗原第91页/共122页辅因子PCNA(增殖细胞核抗原)

促进δ酶与模板/引物相互作用

复制因子C（RF-C）

具有ATP活性，是δ酶的辅助因RF-A

真核生物的单链结合蛋白第92页/共122页第93页/共122页二、DNA复制的过程(1)Initiation(起始)(2)Elongation(延伸)(3)Termination(终止)第94页/共122页(1)Initiation(起始)大约20~50多个复制子在S期同时起始。复制子可能在起始区域内的任意位置起始第95页/共122页EarlyS-phase:euchromatin(常染色质)replicationLateS-phase:heterochromatin(异染色质)replicationCentromeric(着丝粒)andtelomeric(端粒)DNAreplicatelast不同区域的染色质起始复制的时间不同第96页/共122页(1)Initiation(起始)每个细胞周期仅起始一次复制

Licensingfactor

(特许因子)：控制真核生物DNA复制复制起始所必需，且复制后失活位于细胞质，在有丝分裂过程中，核膜破裂，进入细胞核第97页/共122页Licensingfactorcontrolseukaryoticreplication

（特许因子控制真核生物DNA复制）LicensingfactornucleusCytoplasmCelldivision;breakdownofnuclearmembraneLicensingfactorensuresthatonlysingleroundofDNAreplicationoccurs.Afterreplication,licensingfactorinactivated.LicensingfactorincytoplasmcannotenterthenucleusAfterreplication,licensingfactorinactivated.LicensingfactorincytoplasmcannotenterthenucleusnewlicensingfactorentersthenucleusnucleusCytoplasm第98页/共122页(1)Initiation(起始)酵母复制起始位点

(ARS-autonomouslyreplicatingsequences(自主复制序列),enablestheprokaryoticplasmidstoreplicateinyeast).

Minimalsequenceof

ARS:

11bp

[A/T]TTTAT[A/G]TTT[A/T](TATAbox)

ORC

(originrecognitioncomplex起始点识别复合物)bindstoARS,uponactivationbyCDKs,ORCwillopentheDNAforreplication.第99页/共122页Yeastreplicationinitiation

第100页/共122页(2)Elongation(延伸)DNA解旋:复制叉ReplicationforkElongation第101页/共122页Replicationfork复制之前需从核小体上解下DNA:50bp/sec,helicases(解旋酶)andRP-A(单链结合蛋白)第102页/共122页单林娜制作Amodelfornucleosomereplication

5.4EukaryoticDNAreplication

第103页/共122页Amodelfornucleosomereplication第104页/共122页Elongation:

三种不同的DNA聚合酶.DNApola:

具有引发酶活性，用于合成RNA引物andsynthesizesRNAprimers.继续延伸DNA链，但很快被其他DNA聚合酶所取代.

DNApold:

用于前导链和后随链的合成)DNApole:RNA引物切除后，用于填补缺口).第105页/共122页第106页/共122页第107页/共122页(3)Termination(终止)染色体DNA呈线状，复制在末端停止。后随链5´端RNA引物去除后留下空隙。(该空隙没有DNA可用来填补)Telomere(端粒)andtelomerase(端粒酶)第108页/共122页53355335+5333355第109页/共122页三、Telomerereplication(端粒复制)1.Telomere:是一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体，是真核生物染色体线性DNA分子末端的结构。对多种不同生物端粒的DNA序列测定，发现其共同特点都是富含G碱基的短序列多次重复。例如，哺乳类动物仓鼠和人类，端粒DNA都有(TTAGGG)n重复可多达数十甚至上百次，并且形成反折式的二级结构。人:5’-AGGGTTAGGGTT-------3’第110页/共122页端粒的功能：保护端粒DNA末端不受外切核酸酶及单链特异的内切核酸酶破坏，稳定染色体末端结构避免染色体发生融合与真核生物染色体线性DNA末端的复制有关。第111页/共122页单林娜制作2．端粒酶（telornerase）20世纪的80年代中期发现了端粒酶，它是一种RNA-蛋白质复合物。端粒酶中的RNA序列常可与端粒区的重复序列互补并作为端粒区重复序列延长的模板。端粒酶中的蛋白质部分具有逆转录酶活性，能以其自身携带的RNA为模板逆转录合成端粒DNA。5.4EukaryoticDNAreplication

第112页/共122页telomerase（端粒酶)

----防止端粒缩短的酶组成

protein(DNApolymerase)+RNA(telomericDNAsynthe