疾病相关基因的发现及功能研究演示文稿

疾病相关基因的发现及功能研究演示文稿现在是1页\一共有91页\编辑于星期二（优选）疾病相关基因的发现及功能研究现在是2页\一共有91页\编辑于星期二人类基因组及表达概况人类单倍体基因组由3.2xl06bpDNA组成，含有2～3万个基因在一般情况下任何类型的细胞大约只表达一部分基因，约产生5000-15000种蛋白质每一特定发育时期或每种组织特异表达其基本与独特的蛋白质正常成人体内约含有250种以上不同类型细胞现在是3页\一共有91页\编辑于星期二每种细胞大约表达300—400种不同于其他细胞的特异性蛋白质脊椎动物细胞总蛋白的35％80％在各种组织之间互不相同而构成所谓标志蛋白，也称看家基因如糖代谢、DNA修饰和蛋白合成等有关酶的选择性表达基因多为低丰度的基因我们对其中绝大部分基因及表达产物功能尚不了解，在疾病中的意义不明现在是4页\一共有91页\编辑于星期二基因的表达调控基因的表达主要是通过：控制转录转录的启动转录的速度转录后的修饰控制翻译实现翻译的启动翻译后的修饰现在是5页\一共有91页\编辑于星期二基因差异性表达的研究策略现在是6页\一共有91页\编辑于星期二转录水平：差异性表达mRNA水平分析

DDRT-PCR技术差减杂交抑制差减杂交基因表达系列分析(SAGE)翻译水平:proteinelectrophoresis现在是7页\一共有91页\编辑于星期二转录水平现在是8页\一共有91页\编辑于星期二方法基本要求寻找mRNA表达的差异,至少要满足下列要求在一定时、空里,约有15000种mRNA表达/cell,除少数属高丰度、大量的属于低丰度表达,使用的方法足以显示低丰度mRNA重复性要好实验过程中能够步步验证比较得到的产物能代表相应的mRNAs或cDNAs,并能由此找到相应的cDNA序列省时,简便易行现在是9页\一共有91页\编辑于星期二A、差减杂交(subtractivehybridization)差减杂交是利用目的基因在两种组织或细胞中表达的差异，通过其mRNA或单链cDNA进行液相杂交，除去两者之间相同的基因成分取得。现在是10页\一共有91页\编辑于星期二ControlExperimentmRNART→cDNA标记生物素不标记生物素现在是11页\一共有91页\编辑于星期二Hybridization生物素亲和层析柱未结合的洗脱下来克隆、测序得到差异表达基因现在是12页\一共有91页\编辑于星期二优点利用降低了复杂度的差减文库进一步作差异杂交，能够显著提高差异杂交的效率缺点目的基因片段的富集程度有限假阳性比例较高需大量的mRNA(>20mg)现在是13页\一共有91页\编辑于星期二B、抑制差减杂交(supressionsubtractivehybridization,SSH)原理：以抑制PCR为基础的cDNA消减杂交方法：利用非目标序列片段两端的长反向重复序列在退火时产生“锅一柄”结构，无法与引物配对，从而选择性地抑制非目标序列的扩增现在是14页\一共有91页\编辑于星期二TestControlmRNART→cDNARsaI/HaeIII酶切现在是15页\一共有91页\编辑于星期二TestcDNA分成两部分连上接头加入过量的controlcDNA变性后杂交连上接头现在是16页\一共有91页\编辑于星期二第一次杂交

第一次杂交后有4种产物：a是单链testcDNAb是自身退火的testcDNA双链C是test和control的异源双链d是单链controlcDNA目的第一次杂交是使test单链cDNA均等化，使原来有丰度差别的单链cDNA的相对含量达到基本一致现在是17页\一共有91页\编辑于星期二原理丰度高的单链cDNA在退火时产生同源杂交的速度要快于丰度低的单链cDNA.目的由于testcDNA中和controlcDNA序列相似的片段大都和control形成异源双链分子C，使testcDNA中的差异表达基因的cDNA得到大量富集现在是18页\一共有91页\编辑于星期二第二次杂交合并两份杂交产物，另加上新的变性control单链，再次杂交退火只有第一次杂交后剩余的经均等化和消减的单链testcDNA能与controlcDNA一起形成各种双链分子这次杂交进一步富集了差异表达基因的cDNA,并产生了一种新的双链分子e，这种分子的两个5'端有两个不同的接头，正是由于这两个不同的接头，使其能在以后的PCR中被有效地扩增。现在是19页\一共有91页\编辑于星期二巢式(Nest)PCR两次杂交后，填平粘性末端，利用巢式PCR(nestedPCR)原理进行扩增e型分子两端都能和引物配对，扩增效率高c型的双链分子只在一端有一个引物配对，扩增效率比e型分子低得多b型分子由于两端有长序列的反向重复，可互补形成牢固的“锅一柄”二级结构，无法进行有效扩增e就是差异表达的基因现在是20页\一共有91页\编辑于星期二抑制消减杂交法的优点降低假阳性率两步杂交和两步PCR，保证了该方法具有较高的特异性具有高度敏感性：它的均等化和对目标片段的富集，保证了低丰度mRNA也有被检测的可能现在是21页\一共有91页\编辑于星期二抑制消减杂交法的缺点该方法若是mRNA量不够，那么低丰度的差异表达基因的cDNA很可能会检测不到其次，消减库中的cDNA因为已被限制酶消化，不再是全长cDNA步骤繁琐，工作量大现在是22页\一共有91页\编辑于星期二C、限制型差异显示PCRmRNA反转录成双链cDNA再用同一限制酶(首先识别4bp的酶)消化cDNA并把酶切片段分别加上接头后进行特异PCR扩增获得差异表达片段现在是23页\一共有91页\编辑于星期二优点通过使用限制酶将cDNA杂交度降低降低了杂交后无关重复序列对富集的靶序列的污染假阳性率相对低得多现在是24页\一共有91页\编辑于星期二缺点但RDA无法检测缺乏合适内切酶位点的表达序列类似抑制差异杂交技术，它只能获得较短的靶基因探针，用几个甚至几十个探针分别去筛选全长cDNA绝不是一件容易的事情另一方面cDNARDA降低复杂性也可能造成一些信息的丢失现在是25页\一共有91页\编辑于星期二D、mRNADDRT-PCRmRNAdifferentialdisplayRT-PCRThreetechniquesRT:Reverse-Transcription:PCR:PolymeraseChainReactionPAGESequencegelelectrophoresis现在是26页\一共有91页\编辑于星期二ControlExperimentmRNARTPCR现在是27页\一共有91页\编辑于星期二PAGEelectrophoresisControlExperimentDownregulatedgeneUpregulatedgene现在是28页\一共有91页\编辑于星期二DifferentialDisplaygeneT-cloneSequenceInformaticsanalysis现在是29页\一共有91页\编辑于星期二VerifyNorthernblotRT-PCRTraltimeRT-PCRConclusion现在是30页\一共有91页\编辑于星期二GenefunctionanalysisOverexpressionRNAiTissuedistributionSub-celllocationKnockoutTransgeneInvitroanalysisInvivoanalysisImmunohistologyConfocal&Microscopy现在是31页\一共有91页\编辑于星期二优点

同其他方法相比较微量样品：仅需0.2μg总RNA作为起始材料高通量：可同时分析多组样品敏感性：高,可检出低丰度mRNA实验周期：短,约8天即可完成,便于重复脚踏实地：步步验证比较可简单地将DD的特点概括为“3SRV”,即“Simplicity,Sensitivity,Speed,Reproducibility,Versatility”

现在是32页\一共有91页\编辑于星期二

同其他方法相比较一是假阳性多(约50%～70%)二是得到的有差异cDNA片段短(约为110～500bp)缺点现在是33页\一共有91页\编辑于星期二假阳性的原因提取总RNA时,有染色体DNA污染,此DNA作为模板在PCR过程中被扩增从聚丙烯酰胺胶上挑选有差异条带时,实验组与对照组间信号对比不够显著在克隆阶段挑选阳性菌落时,未能排除基因克隆中的假阳性研究中多次使用PCR技术,很难避免实验室环境中的交叉污染现在是34页\一共有91页\编辑于星期二解决方法提取RNA操作严格,得到的RNA必须经过脱氧核糖核酸酶I(DNaseI)充分消化,去除染色体DNA污染切取有差异条带时,首选实验与对照间信号差异显者,最好是互为有或无的关系;仅仅是强与弱的关系,放在次选位置上即使是差异显著地显现为一条带,也不能肯定是由某一cDNA的均一分子泳动而成,有可能是结构不同而分子量相同的cDNA共泳动的结果交叉污染问题的克服应服从分子生物学一般原则金标准：差异基因最终确认用Northern杂交现在是35页\一共有91页\编辑于星期二其它方法基因表达系列分析(serialanalysisofgeneexpression，SAGE)DNA芯片(DNAChips)几种方法的综合运用现在是36页\一共有91页\编辑于星期二翻译水平差异表达研究策略现在是37页\一共有91页\编辑于星期二蛋白质水平分析蛋白质组学：一个蛋白质组是由一个基因组或任何细胞／组织表达的所有种类蛋白质同一种mRNA可因不同的剪接或翻译后加工产生多种蛋白质，故一个蛋白质组的蛋白质数量可超过相应基因组的基因数目现在是38页\一共有91页\编辑于星期二蛋白质组学研究常用技术二维凝胶作图(2D—gelmapping)：二维凝胶作图是在同一块凝胶上，一个面上依据蛋白质的等电点(pI)，另一面上依据蛋白质的分子量进行电泳，将各种不同蛋白质分开，这种方法可同时分析数千种蛋白质凝胶的高分辨率和高度重复是运用二维凝胶电泳分离许多种复杂蛋白质混合物的前提现在是39页\一共有91页\编辑于星期二二维凝胶作图方法2种方法：垂直平板凝胶(verticalslabgels)超薄水平凝胶(ultra-thinhorizontalgels)均采用梯度凝胶(9-16％聚丙烯酰胺)，可分离5--200kD蛋白现在是40页\一共有91页\编辑于星期二检测根据实验目标和所需灵敏度采用银染、考马氏亮蓝或放射自显影检测采用激光密度扫描(laserdensitometer)、磷显影仪(phosphor-imager)等扫描装置现在是41页\一共有91页\编辑于星期二结果分析现在是42页\一共有91页\编辑于星期二二维凝胶参照图谱(2D-gelreferencedmaps)利用电子计算机分析构建二维凝胶参照图谱最后通过微测序、肽图(peptidmapping)、免疫和cDNA短暂超表达等研究最后确立蛋白质结构，并与蛋白数据库及DNA数据库的信息进行比对、分析得出结论现在是43页\一共有91页\编辑于星期二脑缺血/缺氧相关基因的克隆现在是44页\一共有91页\编辑于星期二研究背景、目的脑缺血（缺血性中风）特点：常见病、多发病、高致残率、高死亡率，年新发病例超过150万脑缺血致脑损伤机理:自由基、能量消耗、兴奋性氨基酸毒性、钙超载、细胞凋亡学说目前存在的问题：脑缺血发病机理复杂、涉及的许多环节尚未完全阐明、作用靶点缺乏特异性，临床疗效不佳。目标：寻找新的靶点体内存在脑缺血保护性因素，我们的研究目的就是揭示和阐明这些内在保护性机制，寻找新的预防和治疗脑缺血的靶点现在是45页\一共有91页\编辑于星期二研究技术路线

制作MCAO大鼠脑缺血模型↓荧光差异显示PCR

↓

脑缺血相关差异显示EST片段的获得↓

差异显示EST片段的筛选确认

↓

获取目标基因全长

↓

生物信息学分析研究

↓↓

制备抗体基因表达的功能研究

↓过表达RNAi转基因动物

↓↓↓↓

组织表达谱分析体内外体内外子代性状研究

现在是46页\一共有91页\编辑于星期二

动物：250-280gSD雄性大鼠。采用MCAO(MiddleCerebralArteryOcclusion)大脑中动脉栓塞模型：TTC染色结合动物行为学改变确认模型成功取大鼠脑缺血2小时

缺血侧组织非缺血侧组织进行研究脑缺血模型的制作RLR:ischemia;L:non-ischemiaStainwithTTC现在是47页\一共有91页\编辑于星期二缺血与非缺血组织RNA的提取提取RNA的纯度和完整性纯度检验：

A260/A280＝1.96

完整性检验：电泳结果见图2Fig2TheelectrophoresisofRNAofcerebralischemiaandnon-ischemia现在是48页\一共有91页\编辑于星期二

差异显示PCR结果(图谱)现在是49页\一共有91页\编辑于星期二NumberAlignmentresultfromGenBankNumberAlignmentresult81Homosapiensnuclearmatrixprotinp8425New10Cysteinedioxygenase54New12MusmusculusCCR4-NOTtranscriptioncomplexR51NewR34Musmusculusab1-interactor1R66NewR41HomosapiensCG-99proteinR81NewR71MIR16R92NewR101Tissueinhibitorofmetalloproteinase3geneR111NewR162Homosapiensnuclearreceptorco-repressorR122NewR123Tissueinhibitorofmetalloproteinase3geneR132NewR18PeptideChainReleaseFactor1R19BACcloneRP24-462J14fromchromosome19部分差异片段测序结果表

1FDDRT-PCR差异显示EST序列同源性分析结果(2001年分析结果).Tab.1TheblastresultsofsequenceassayfromdifferentialdisplaybyFDDRT-PCR.现在是50页\一共有91页\编辑于星期二小结共获得了146个与脑缺血相关的EST片段。其中9个为新的EST片段。现在是51页\一共有91页\编辑于星期二脑缺血相关基因YZ-2的筛选及确认现在是52页\一共有91页\编辑于星期二差异显示基因初筛Fig4,5,6RT-PCRscreening(20fragment)采用RT-PCR技术进一步验证已经克隆的EST片段的在脑缺血中的差异表达456现在是53页\一共有91页\编辑于星期二反相NorthernBlot印迹分析结果Fig9PartialDotNorthernBlotanalysis现在是54页\一共有91页\编辑于星期二差异表达EST片段的生物信息学分析Fig3BlastanalysisresultsfromGeneBank现在是55页\一共有91页\编辑于星期二片段R6RT-PCR的结果R6β-actinM:Marker;Lane1:Non-ischemia;Lane2:β-actin;Lane3:Ischemia;Lane4:β-actinFig8RT-PCRresultofR6(n=6)*P<0.001Fig9ThevolumeratioofR6andβ-actinbandinRT-PCR现在是56页\一共有91页\编辑于星期二R6片段的RT-PCR半定量分析结果表

2R6与β-actinRT－PCR扩增产物的灰度扫描体积比值

Table2ThevolumeratioofR6andβ-actinbandinRT-PCRGroupnVR6/mm3

Vβ-actin/mm3VR6/mm3/Vβ-actin/mm3Ischemia6382910±5892

201876±2374

1.8968±0.2356*Non-ischemia6109823±1562213875±31220.5135±0.1021

Comparewithnon-ischemia*P<0.001现在是57页\一共有91页\编辑于星期二大鼠脑缺血相关基因EST片段R6的确定Fig

10PartialFDDRT-PCRResultsFig112002-3-5BlastResultFig12DotblotResultsFig13RT-PCR101112R6β-actin13

小结现在是58页\一共有91页\编辑于星期二YZ-2基因全长的克隆现在是59页\一共有91页\编辑于星期二

利用5‘RACE技术克隆R6全长

5’RACE主要步骤

RNA的制备

↓

片断特异引物反转录成cDNA↓RNA连接酶环化

↓

NestPCR反应↓产物TA克隆测序

Fig14Mechanismof5’RACE现在是60页\一共有91页\编辑于星期二

第一轮5‘RACE引物的设计RT：5’-TGGTGTCTAATGCTC-3’

F1：5'-AGGTCTTAGGTTCCTTTTGAGTCTG-3’R1：5'-GTGCTTGCTGACATGTACTGTTGC-3’GCAACAGTACATGTCAGCAAGCACS2：5’-CCTTCTCTTTGTAAGTTCTGTTGAG-3’A2：5’-ATAGCCATACTGTTCCCTAGCAG-3’CTGCTAGGGAACAGTATGGCTAT

5’ATTACAGGCAAATTGGGCATACTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTTAAATACTTGGCGTAATCATGGTNATACTTGTTTCTGTGTGAAACAGGACTGCTAGGGAACAGTATGGCTATTATAAAACACCTTTCAAGTATGAACTGCATGTTTGTTCAATGTCTTTCCGGTGGAATAATTCCTAGCAAGCAACAGTACATGTCAGCAAGCACATGTGTTGAAGGCTAAGATATAAATTTTGAAAAACTACAATAGNAACAAAAGTAAAGGTCTTAGGTTCCTTTTGAGTCTGTCAACCACACACTATTATATTAAATTGTCATTATTATTTTCATAGAAGAAAATGTATATTATTTCTTTTGATCTTTACAGGACATGAATAGAAATAATGTTTATTTATATAGAACCTAAGCAAAAATCCTCATATATATGTTCAAGTCATCACAGCATGAGTAATTTTGAAGTTTTAACTCACCCCCCTTCTCTTTGTAAGTTCTGTTGAGCATTAGACACCAGTAAAANTATTTTAAACCCGAAAAAAAAAA

3’现在是61页\一共有91页\编辑于星期二NestPCR产物的电泳图15Fig151stPCRofNestPCRFig162ndPCRofNestPCRM:marker;Control:BlankControl;R+F:Upper+lowerprimer;F:Upperprimer;R:lowerprimer16现在是62页\一共有91页\编辑于星期二RACEPCR产物的克隆及酶切鉴定按照常规方法进行凝胶回收与T载体的连接重组质粒的转化重组质粒DNA的抽提及酶切鉴定(见图17)Fig17TAsubcloneandIdentifypositiveclonesbyrestricatedenzymeEcoRIdigestion.

Lane1,2,3,4:TheplasmidwerenotdigestedbyEcoRI.

LaneM:Marker.Lane5,6,7,8:Thelane1andlane2plasmidsweredigestedbyEcoRI.

现在是63页\一共有91页\编辑于星期二第一轮测序图谱Fig18Sequenceresultsofproductfromfirst5’RACE

现在是64页\一共有91页\编辑于星期二NorthernBlot印迹分析结果Fig19Northernblotresults.LaneM:markerLaneR6:ischemialateral

现在是65页\一共有91页\编辑于星期二22NorthernBlot确认YZ-2差异表达Fig22:Afterusingnon-DIGlabeledprobe:DIGlabeledprobe=50:1

2021Fig20:BeforehybridizationLaneL:Nonischemia;LaneR:IschemiaFig21:Afterhybridization现在是66页\一共有91页\编辑于星期二第二轮RACE引物设计Northern印迹分析我们尚未获取YZ-2基因全长，在首轮RACE的序列靠近5‘端的位置设计引物。RT：5’-CCAAATGAAGTCTTACCT-3’A2：5’-AGGAGGAAACTGAGGCCCAGAGAAG-3’S2：5’-AGGCTGTAATCAGAGCTGCCGTATG-3’A1：5’-TGGCGGTTCTGAAGGTCGGGATAGT-3’S1：5’-GGACTGGGCATCAGGGTCTCCACT-3’现在是67页\一共有91页\编辑于星期二第二轮RACEPCR电泳图谱Fig231stPCRofNestPCRFig242ndPCRofNestPCRM:marker;Control:BlankControl;R+F:Upper+lowerprimer;F:Upperprimer;R:lowerprimerFig23Fig24现在是68页\一共有91页\编辑于星期二R6全长的拼接5’3’EST片段第二次RACE片段2778bp第一次RACE片段1500bp543bp4821bp将R6命名为YZ-2基因。现在是69页\一共有91页\编辑于星期二小结成功建立了利用5‘RACE技术克隆未知基因序列的策略，成功克隆出YZ-2基因全长，NorthernBlot印迹分析证实了该结果。NorthernBlot印迹分析进一步确认了YZ－2基因在脑缺血中出现上调差异表达。现在是70页\一共有91页\编辑于星期二YZ-2基因功能的研究生物信息学分析现在是71页\一共有91页\编辑于星期二生物信息学分析网站和工具进行基因/蛋白质功能分析的网站和工具：：ProtScale交互式在线电脑分析软件：Swiss-Prot数据库：DNASTAR电脑分析软件现在是72页\一共有91页\编辑于星期二生物信息学对YZ-2蛋白一级结构及理化特性的分析YZ-2蛋白一级结构及理化特性：编码氨基酸：244animoacids

理论等电点(pI):9.52

分子量(MW)：29280.0DA

酸性氨基酸残基总数(Asp+Glu):2

碱性氨基酸残基总数(Arg+Lys):7

分子式（Formula）:C801H1203N217O234S6

原子总数（Totalnumberofatoms）:2461

预期半衰期（Estimatedhalf-life）:1hr(invitro)2min(yeast,invivo).2min(Escherichiacoli,invivo)现在是73页\一共有91页\编辑于星期二YZ-2基因编码的氨基酸序列RHLPPPVDTGTENRTYQASSAAFRYTAGTPYKVPPTQSNTAPPPYSPSPNPYQTAMYPIRSAYPQQNLYAQGAYYTQPVYAAQPHVIHHTTVVQPNSIPSAIYPAPVAAPRTNGVAMGMVAGTTMAMSAGTLLTTPQHTAIGAHPVSMPTYRAQGTPAYSYVPPHW（244aa）现在是74页\一共有91页\编辑于星期二生物信息学对YZ-2抗原性的分析

抗原性分析（Antigenicity）(1)Score1.136length57atresidues54->110（Middle）(2)Score1.136length8atresidues156->163(C-terminal)(3)Score1.101length12atresidues138->149(C-terminal)(4)Score1.070length11atresidues42->52(N-terminal)(5)Score1.056length9atresidues17->25

(N-terminal)

现在是75页\一共有91页\编辑于星期二生物信息学同源性分析结果

核酸数据库

1.GeneBank2.EMBL3.DDBJ

蛋白质数据库1.SWISS-PROT2.PDB

3.Prosite

与大鼠脑中的KIAA0280基因高度同源，同源性达96％。蛋白质同源性分析表明:该蛋白质序列为新的蛋白。现在是76页\一共有91页\编辑于星期二

小结生物信息学分析结果：首次发现YZ-2为一新的蛋白质。现在是77页\一共有91页\编辑于星期二YZ-2基因功能的研究抗体制备及皮层细胞体外缺氧模型的建立现在是78页\一共有91页\编辑于星期二免疫多肽的设计与合成

生物信息学对抗原性（Antigenicity）分析预测

Score1.136length8atresidues156->163Score1.101length12atresidues138->149144166

↓

↓

CPVSMPTYRAQGTPAYSYVPPHW

↓

化学合成↓含22aa的多肽（纯度97％）现在是79页\一共有91页\编辑于星期二YZ-2多克隆抗体的制备抗体制备的步骤多肽+福氏佐剂乳化家兔皮下多点接种程序化多次注射抗体检测

效价检测(Elisa)特异性检测(Westernblot)现在是80页\一共有91页\编辑于星期二多克隆抗体制备检测结果Fig30Thevalencassayresultofmulti-cloneantinodyproducedfromrabbitbyman-madesynthezedpolypeptide.抗体效价1:25600现在是81页\一共有91页\编辑于星期二WesternBlot

分析图31YZ-2在脑缺血组织中的表达的Western印迹分析Fig31ThewesternblotanalysisofexpressionofYZ-2incerebralischemiaLaneM:marker;Lane1:Ischemiafor0.5hr;Lane2:Control;Lane3:Ischemiafor2hrs;Lane4:Control.Arrowshowthemolecularweight(MW)ofYZ-2DaDa现在是82页\一共有91页\编辑于星期二大鼠皮层细胞体外缺氧模型的制备

实验步骤:密闭容器内放入培养7-8d的胎鼠皮层细