内含子对真核基因表达调控的影响(精)

生物技术通报•综述与专论•BIOTECHNOLOGYBULLETIN2008年第4期内含子对真核基因表达调控的影响王悦冰摘要：郎志宏黄大昉（中国农业科学院生物技术研究所，北京100081）大多数真核基因都含有非编码的间隔序列 内含子，根据剪接机制的不同，可将内含子分为3类：真核自我剪接内含子和真核tRNA内含子。在多数情况下，真核mRNA内含子的存在可以提咼基因的表达水mRNA内含子、平，因为其剪接过程会影响mRNA新陈代谢的多个阶段，包括转录、RNA编辑、pre-mRNA的加工、mRNA的出核运输、翻译和无义衰变等。真核mRNA内含子在真核生物基因表达调控中起着重要的作用，是转基因研究中提高外源基因表达的重要元件之一。就真核mRNA内含子的特性、剪接机制及其对真核基因表达调控的影响作一概述。关键词：内含子剪接基因表达调控Effects0fPre—mRNAIntr0ns0nRegu1atj0n0fEukary0tjcGeneEXPressj0nWangYuebjngLangZhjh0ngHuangDafang(Bj0techn010gyResearchInstjtuteJChjneseAcademy0fAgrjcu1tura1ScjencesJBejjjng100081)Abstract:M0steukary0tjcgenesarejnterruPtedby0ne0rm0ren0nc0djngjnterVenjngsequences(jntr0ns)Intr0nsarec1assjfjedjnt0threetyPesbased0nsP1jcjngmechanjsm:Pre—mRNAjnt

r0nsJtRNAjntr0nsandse1f—sP1jcjngjntr0ns-InmanycasesJPre—mRNAjntr0n—c0ntajnjngVersj0nscaneXhjbjtdramatjca11yhjgheXPressj0nPr0fj1esJbecausejntr0nsp1jcjngcanjnf1uencea1m0sta11stePs0fmRNAmetab01jsmjnc1udjngtranscrjPtj0nJcaPPjngJRNAedjtjngJPre—mRNAPr0cessjngJtrans1atj0nanddecay0fmRNAPr0ductsIntr0nhasbec0meanjmP0rtantfact0rjnregu1atj0n0feukary0tjcgeneeXPressj0nandthestrategjc0Ptjmjzatj0n0ftransgeneeXPressj0n-InthjsPaPerJthefeaturesandsP1jcjngmechanjsm0fPre—mRNAjntr0nsJandtheeffects0fPre—mRNAjntr0nsjnregu1atj0n0feukary0tjcgeneeXPressj0nwerereVjewedKeyw0rds:Intr0nSP1jcjngRegu1atj0n0fgeneeXPressj0n真核生物基因的一个基本特征是它们被一个或多个内含子所间隔，这些间隔DNA在转录后被除去以形成具有完整读码框的mRNA，这一过程叫做内含子的剪接。根据剪接机制的不同，可将内含子分为3类：真核mRNA内含子、自我剪接内含子和真核tRNA内含子。真核mRNA内含子最初被认可的功能主要有2种，一是通过外显子的复制和移动简化新基因的进化历程；二是通过可变剪接由单基因表达多种蛋白，丰富了蛋白的多样性。随着分子生物学的发展，人们发现真核mRNA内含子对基因表达的调控不只发生在前体RNA的剪接阶段，而是与转录、RNA编辑、mRNA的出核运输、mRNA翻译和无义衰变等过程形成一个网络，共同调控基因表达［1一4］。虽然一些基因本身并不含有内含子，或是表达并不需要内含子的参与，但在许多情况下，真核mRNA内含子的存在都可以大大提咼转基因生物的基因表达［5,6］，真核mRNA内含子已成为提高转基因生物外源基因表达的重要元件之一。1真核mRNA内含子的特征和剪接机制1.1U2-型内含子的特征及剪接机制随着基因组测序计划的进行，人们发现大多数的真核基因都含有内含子，并且主要是真核mRNA收稿日期:2008-02-25基金项目：国家自然科学基金（30500039）和中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（中国农业科学院生物技术研究所）资助项目作者简介：王悦冰，女，博士研究生，研究方向：生物化学与分子生物学，E-mail:smilewang@163.com通讯作者：黄大昉，研究员，dfhuang@2生物技术通报BiotechnologyBulletin2008年第4期内含子。真核mRNA内含子有两种类型：U2-型内含子和U12-型内含子，U2-型内含子存在较为普遍，占总数的99%，而U12-型内含子含量较少（＜0.4%）。剪接位点（5'U2-型内含子的5'splicingsite,5，剪接位点具有ss）具有AG/GTAAGT的保守序列，3'种组分分别为U11,U12,U4atac,U6atac，与之对应的U2型内含子剪接体组分为U1,U2,U4和U6,虽然这些组分的序列不尽相同，功能位点却十分保守。值得注意的是，GT-AG型内含子经常被U12型剪接体剪接，AT-AC型内含子也可以被U2型剪接体剪接，可见是内含子的整个序列，而不只是边界序列决定到底是哪一种剪接体起作用［16］。至今为止，只对极少数的U12型内含子进行了研究°Lewandowsk等［17］分离了拟南芥CBP20,GSH2和LD基因的内含子，并对3个内含子的剪接位点、分支点、UA含量进行了突变分析，结果显示U12型内含子的剪接依赖于一系列要素，包括UA含量、邻近的外显子序列、ESEs（ExonSplicingEnhance「sequences）等，各要素都会影响其剪接效率（图1）。TGCAG/G（3'splicingsite,3'ss）的保守序列（图1）。_分支点位于3'ss上游大约20_30nt处，序列并不保守，一般含有一个腺苷酸，突变或缺失腺苷酸会降低剪接的效率或导致pre-mRNA无法剪接。脊椎动物内含子分支点下游还有一段多聚嘧啶序列，是其他生物内含子不具有的。植物内含子的一个显著特点就是富含UA序列，UA序列均匀的分散在整个内含子当中，对于保证剪接的保真度和精确性起着关键的作用［7］。U2-型内含子的剪接包括两步连续的转酯反应：第一步，分支点腺苷酸的2'剪接-0H亲核攻击5'端位点的磷酸集团，产生套索状中间物和自由的5'外显子的羟基亲核攻击3'剪接位外显子。第二步5'点的磷酸二酯键，去除套索状的内含子序列，同时将相邻的两个外显子连接起来［8］ 。整个剪接反应由一个巨大的核糖核蛋白体(RNP)-剪接体(spl1ceosome)介导。剪接体的装配是高度有序和动态的反应，包括RNA-RNA,RNA-蛋白，蛋白-蛋白之间的相互作用。在剪接过程中RNA结合蛋白，RNA解旋酶，蛋白激酶等多种蛋白因子参与其中，保证了外显子、内含子的序列被有效的区分，5'ss和3'ss被正确的选择［10］。［9］图1U2型和U12型内含子结构示意图(引自Lorkovieetal.［38］)脊椎动物、酵母、植物的U2型内含子后生动物和植物的U12型内含子2真核mRNA内含子对基因表达调控的影响许多基因如卩胸腺激素合成酶、嘌吟-球蛋白、1.2U12-型内含子的特性及剪接机制虽然U12-型内含子含量较少，但是在植物、哺乳核苷磷酸化酶基因当以cDNA形式存在时，表达效率极低，而当有内含子存在时，表达水平会大大提高。在线虫、昆虫、哺乳动物、植物中都发现内含子的存在对基因表达有着积极的作用，内含子已经成为提高外源基因表达的重要元件。下面就真核动物、昆虫的核基因组中均有发现［11,12］。第一个发现的U12-型内含子是以AT双核苷酸开始，AC双核苷酸结束，所以U12-型内含子又被称为AT-AC型内含子。后来发现U12-型内含子也有GT-AG型的，此外还有一小部分边界并不规则［11］°U12-型内含子5'-mRNA内含子对基因表达调控的影响作一综述。ss(G/ATATCCTY)和分支点(TCCTTRAY)序列高度保守［13,14］,而3'ss序列的保守性稍差(YAC/G)，与分支点之间距离大约为10—20nt。植物U12-型内含子也富含UA序列，与U2-型内含子相似。2.1真核mRNA内含子对转录的促进作用许多基因中的内含子都可以刺激转录的效率，如转基因鼠的转录效率会因内含子的去除而降低100倍［18］，邻氨基苯甲酸磷酸核糖基化转移酶(PAT1)基因的两个内含子都可以提高报告基因的转录效率，进而提高报告基因的表达［19］。U12-型内含子的剪接体包括5个小的核糖核蛋白组分。除了与U2型相同的U5snRNP外［15］，其它42008年第4期王悦冰等：内含子对真核基因表达调控的影响3在DNA水平上，内含子以2种方式影响转录。一种方式是通过内含子序列本身含有的转录增强元件或抑制元件。目前在许多基因的内含子中都发现了转录调控元件，其中大多为增强元件°Chang等［20］发现猪的MyHC(MyosinHeavyChain)基因内含子中存在转录调控元件，可以通过调控转录的起始来增强基因的表达。内含子影响转录的另一种方式是通过调节核小体的位置来控制DNA的可接近性［21］。在对转基因鼠的研究中发现鼠生长激素基因的内含子可以通过促进核小体靠近启动子的有序排列来刺激转录［,22］。最近研究表明RNA聚合酶II的CTD(C-terminal合复合体(cap-bindingcomplex)可以促进U1snRNP与5'剪接位点之间的作用［27］，通过加强U6对U1sn通过酵母双杂交系统RNP的替换，促进剪接的进行。筛选得到可能介导CBC与剪接体相互作用的蛋白因子HnRNPF,HnRNPF可以特异性地与CBC亚基相互作用，去除HnRNPF的抽提物剪接效率明显下降［28］。2.2.2内含子剪接与3'端形成与5'加帽不同的是，mRNA3'末端的形成与内含子剪接之间的作用是相互的。体外研究发现，上游的3'剪接位点可以有效增强下游多聚腺苷酸化的效率，而3'polyA尾巴也会促进3'ss的识别，两者之间的促进作用会使domain)在pre-mRNA加工中起着重要的作用，CTD既是转录和pre-mRNA加工的平台，又是它们的调节子。U1snRNA是剪接体的重要组分，可以与转录起始因子TFIIH相互作用，进而增强RNA聚合酶mRNA的累积量大大增加［28］。这些反应的分子基础是剪接因子与多聚腺苷酸化作用因子之间的直接作用。另外，剪接还会影响PolyA位点的选择，导致不同基因产物的产生。如在IgM基因中，内含子内部相对较弱的PolyA位点会由于U1-70K的作用而剪接位点的抑制，产生含有内含子的的受到上游5'转录本［29］。II的转录起始能力［23］。另外，内含子内部的剪接信号可以通过与3种转录延伸因子相互作用增强RNA聚合酶II的持续合成能力。转录延伸因子pTEFb能够磷酸化CTD的丝氨酸（Ser）位点，在装配一个新转录的内含子时，pTEFb集合TAT-SF1、真核mRNA内含子对下游mRNA新陈代谢的促进作用内含子对mRNA运输的促进作用内含子TAT-SF1与剪接因子相互作用，调节剪接复合体的装配，被TAT-SF1结合的剪接复合体可以强烈的刺激转录［24］。最近发现，pTEFb还可以磷酸化另一个转录延伸因子hSPT5［25］，转录延伸因子TFIIS也可与剪接因子等相互作用［26］ORNA聚合酶II的复合体、的剪接与mRNA的输出虽然发生在细胞的不同部位，但这两个过程却是直接相关的。以前曾有报告指出cDNA转录的mRNA不能出核，因此不能够表达蛋白而包含有内含子的mRNA转录本可以有效的输出而被翻译［30］,说明内含子对mRNA的出核运输有促进作用。最近研究发现含有内含子的转录本是由不同于cDNA转录本的促进出核的mRNP复合体所装配°mRNP中剪接因子UAP56可以将输出因子Aly结合到mRNA上，ALY与mRNA出核受体2.2内含子剪接与其它pre-mRNA加工事件的相互作用除了内含子的剪接，pre-mRNA的加工事件还包括5'端的加帽，3'端的裂解和多聚腺苷酸化作用，RNA编辑等。这些加工事件对基因表达调控至关重要，虽然是被独立发现的，但在时间和空间上却是相互偶联的。TAP之间相互作用，将mRNA运送到核孔处出核翻译。但是应该指出的是虽然剪接可以促进mRNA的输出，但是剪接并不是mRNA出核所必须的，因为许多运输因子都可以独立于剪接而单独作用。本身不含内含子的转录本（组蛋白等）是靠本身含有的特异序列与输出因子结合，不需要剪接体的协助［31］o剪接体的另一作用是将未剪接的转录本保留在细胞核中，促进成熟正确剪接的mRNA输出。剪接因子hnRNP将初级和部分剪接的转录本包裹起2.2.1内含子剪接与5'端加帽在RNA聚合酶刚刚合成20_30nt后，聚合反应暂停，通过一个3步反应将帽（cap）结构加入到pre-mRNA的5端。许多实验都证明了加帽对剪接的促进作用。把含有多个内含子的pre-mRNA加入到在核抽提物中，发现帽子结构可以增强帽子近端第一个内含子的切除，但对第二个内含子的剪接效率影响不大。帽结4生物技术通报BiotechnologyBulletin2008年第4期来保留在核中，mRNP/输出因子复合体将成熟的中，如终止密码子与下游外显子接头处间距大于itiRNA带出细胞核。然而，在一些反转录病毒中，一些蛋白的表达往往需要非转录或部分转录本的存在，这些病毒基因在内含子中通常包括与特异病毒或细胞运输因子相互作用的顺式作用元件，所以能够打破核滞留[严]。0_55nt,贝被认为是早熟的，相应的mRNA会被降解。最近研究发现EJC包含与NMD作用的重要因子。在剪接因子RNPfl和蛋白因子Y14的作用下，输出因子hUPF3结合到EJC上，这些因子伴随mRNA进入细胞质，在细胞质中被翻译终止复合体Braddock等人]33]所检测。在第一轮翻译后，这些蛋白因子虽然从2.3.2内含子对翻译的促进作用发现当将成熟的mRNA直接注射入非洲爪蟾(Xenopus)卵母细胞核中时，mRNA在细胞质中的翻译会受到抑制，这种抑制可以通过在3JUTR处加入可剪接的内含子而消除，说明了内含子对翻译的促进作用。另外，剪接体剪接结束后在外显子接头上游mRNA上剥去，利用特异的蛋白将mRNA降解，但是NMD复合体对入膜的正确mRNA已经有了记忆功能，这就使核内剪接与膜中NMD之间建立起了直接联系。3展望随着分子生物学的发展，越来越多的证据显20—24nt处沉积的EJC(exonjunctioncomplex)可以增强核糖体与mRNA之间的结合[34]。研究发现，将示，真核mRNA内含子在真核基因表达调控中起着重要的作用。在单子叶植物中，玉米adh1和sh1内含子使转基因玉米报告基因的表达水平提高10一EJC组成蛋白Y14、Magoh、RNPS1加入到无内含子的转录本中，翻译的效率会大大提高。当将参与NMD（nonsense-mediatedmRNAdecay）的EJC蛋白因子Upf1、Upf2、Upf3b加入到报告基因ORF（Open端，翻译的产量、核糖体与mRNAReadFrame）的5'之间的结合大大增加［35］，说明参与NMD作用的EJC因子不仅用于消除异常的转录本，在翻译中也担当了新的任务。100倍。在双子叶植物中也观察到了内含子增强表达的现象，但是这种增强幅度较小，一般为2_5倍。实验室将玉米泛素蛋白基因ubiquitin的内含子ubi插入到具有自主知识产权的Bt杀虫基因cry1Ah上游，基因枪法转化玉米愈伤组织，对获得的T1代植株进行了ELISA检测，结果显示ubi使Btcry1Ah的表达量提高了11.9%（王悦冰，未发表）。内含子的剪接通过刺激转录、提高mRNA稳定增强mRNA的翻译等提高性、促进mRNA的输出、基因的表达。但是这些过程是怎么相互联系的，至ij底哪一个步骤占主导地位、起着最为关键的作用还不清楚。外显子接头复合体 EJC中的蛋白因子在mRNA新陈代谢的各个阶段均行驶其功能，无疑是内含子发挥其积极作用的一个关键因子，对EJC的研究有利与解开内含子增强效应的谜团。随着基因组测序计划的进行，人们将会更加深入的了解参与剪接的顺式作用元件和反式作用因子，对内含子的认识将会不断突破，这对于想要优化转基因生物表达的研究者来说，无疑是一个巨大的财富。参考文献Matsumot等［36］发现剪接对翻译的影响与内含子的位置有关。当内含子置于5'-UTR时，翻译会被大大的刺激，而当内含子置于3'-UTR时，翻译的水平会低于无内含子的水平。内含子识别、内含子对位置的依赖、内含子对翻译的影响机理还不甚清楚。但是对于想要优化转基因生物表达的研究者来说，必须关注内含子的位置，这是一个十分重要的元素。当内含子位于表达核的3'-UTR时，除了翻译的效率会降低外，甚至还会引起mRNA的无义衰变，导致更低水平蛋白的表达。2.3.3内含子剪接与无义介导的mRNA衰变（nonse无义介导的mRNAnse-mediatedmRNAdecay,NMD）衰变又名mRNA监视，是指选择性的降解含有早熟终止密码子（prematureterminationcodons,PTCs）的mRNA，对转录后的mRNA进行质量控制［37］°NMD广泛存在于各种真核生物中，可以消除由畸变mRNA产生的截短的有害的蛋白NMD的一个关键步骤是区分早熟的和正常的终止密码子。在哺乳动物123ManiatisTJReedRNatureJ2002,416:499506ProudfootNJJFurgerAJDyeMJ.CellJ2002J108:5015120rphanidesG,ReinbergDCellJ2002J108:439451(下转第8页)810111213141516171819生物技术通报BiotechnologyBulletin(5)•10561065HidalgoE,DempleB,.EMB0J,1997J16(3):109114PomposielloPJ,etal..TrendsBiotechnolJ2001J192008年第4期2021232425262728293031Gonzalez-F!echaB,DempleB.JBacterio1,1997,179(2):382一388.(1):1—6.ZhengM,StorzG.BiochemPharmacol,2000,59(23):6756_6763.ChoYH,etal.JBacteriol,2003,185(10):451_456.AlekshunMN,LevySB.ASMNews,2004,70LeeY,YeomJ,KangYS,etal.JMicrobiolBiotechnol,2007,17(9):1504_1512.(12):3833—383.22Gonzalez-FlechaB,etal.JBacteriol,1999,81GiroM,CarrilloNS,KrappAR.Microbiology,2006,152(Pt4):1119_1128.NiaziJH,KimBC,GuMB.ApplMicrobiolBiotechnol,2007,74(6):1276_1283.(5):1444—ZaimJ,KierzekAM.NucleicAcidsResearch,2003,31

CasazPJGarrjty—RyanLKJMcKenneyDJeta1Mjcr0bj010gyJ2006J(Pt12):36433650152(7082):363'367LeeJwJHe1mannJDNatureJ2006J440(5):577580LeeHJJGuMBAPP1Mjcr0bj01Bj0techn01J2003J601454(5357):17181721ZhengMJeta1ScjenceJ1998J279LeeJHJY0unCHJKjmBCJeta1Bj0sens0rsandBj0e1ectr0njcsJ2007J22:22232229CeraV010RJeta1JNeura1TransmSuPP1J2006J(71):133141(1):140Va1k0MJeta1ChemBj01InteractJ2006J160(1):6978wejdauerEJeta1T0Xjc01LettJ2004J151LeeCJLeeSMJMukh0PadhyayPJeta1NatStructM01Bj01J(12):117911852004J11(5):719729Haus1adenAJPrjVa11eCTJeta1Ce11J1996J86HarjdasVJKjmS0JNjshjmuraGJeta1Pr0cNat1AcadScjUSAJ(29):1008810093•2005102!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!（上接第4页）456789101112131415161718192021MaquatLEJCarmjchae1GGCe11J2001J104:173176Ca11jsJJFr0mmMJwa1b0tVGenesDeVJ1987J1:11831200DunckerBPJeta1M01GenGenetJ1997J254:291296K0CHJBrende1VJeta1P1antM01Bj01J1998J36:573'583SjmPs0nGGJFj1jP0wjczwP1antM01Bj01J1996J32:1'41AAnnuReVBj0chemJ1996J65:367409Sta1eyJPJGuthrjeCCe11199892:315326

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