(4.9)-第八章生物酶工程

AdvancedEnzymeEngineering第八章生物酶工程酶学和以基因重组技术为主的现代分子生物学技术相结合的产物亦称高级酶工程（AdvancedEnzymeEngineering）生物酶工程合成酶杂合体（融合酶）用基因工程技术大量生产酶（克隆酶）酶分子的改造（突变酶/定向进化酶）抗体酶核酶ContentsGoGoGoGoGo第一节酶基因的克隆和表达克隆酶的制备：酶基因的克隆酶的异源表达发酵生产、分离纯化已学习一、酶基因的克隆定义：在体外将各种来源的目的酶基因与载体连接形成具有自我复制能力的DNA分子（即重组载体），然后通过转化或转染等方式将重组载体导入宿主细胞并培养，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取，从而获得大量所需酶基因。目的：获得大量目的酶基因一、酶基因的克隆酶基因克隆的主要操作步骤目的基因的获取克隆载体的选择目的酶基因与载体连接（构建重组载体）重组载体导入受体细胞重组子的筛选与鉴定一、酶基因的克隆1.目的基因的获取①PCR——序列已知，设计引物②基因组DNA文库——先构建，再筛选③cDNA文库——先构建，再筛选（RT-PCR）④人工化学合成——序列已知、片段较短，直接合成目的DNA一、酶基因的克隆2.克隆载体的选择

基因克隆载体：可携带外源基因并将其带入受体细胞得以稳定维持的DNA分子

理想克隆载体的要求：①独立复制子，有复制起始位点，可在宿主细胞中独立自主复制②有若干合适的限制性核酸内切酶位点，便于外源DNA的插入③有易被识别筛选的标志基因④安全，不含对受体细胞有害的基因一、酶基因的克隆3.目的酶基因与载体连接黏性末端连接：T4或E.coliDNA连接酶平端连接：T4DNA连接酶黏性末端-平端连接：

先在DNA片段末端加入人工接头，再进行连接一、酶基因的克隆4.重组载体导入受体细胞导入原核受体细胞（细菌）：制备感受态细胞，转化/转染，培养筛选转化子氯化钙法：Ca2+电穿孔法：高压电脉冲转导：λ-噬菌体颗粒一、酶基因的克隆一、酶基因的克隆一、酶基因的克隆4.重组载体导入受体细胞导入真核受体细胞：酵母细胞：原生质体转化法、电穿孔法动物细胞：电穿孔法、微量注射法、磷酸钙共沉淀法植物细胞：Ti质粒转化法、电穿孔法、微量注射法一、酶基因的克隆5.重组子的筛选与鉴定①载体选择标记法：初步筛选如抗生素抗性、营养缺陷性、蓝白斑筛选等②PCR法③核酸杂交法：标记核酸做探针④免疫学方法——放射性免疫法和酶联免疫法⑤DNA限制性内切酶图谱分析法⑥核苷酸序列测定法一、酶基因的克隆第一节酶基因的克隆和表达二、酶的异源表达

原核基因——原核细胞真核基因——真核细胞/原核细胞表达系统：原核/真核生物基因表达体系

表达过程：DNA转录为mRNAmRNA翻译为蛋白质二、酶的异源表达1.外源基因在原核细胞中的表达原核生物基因表达体系优点：

宿主菌遗传背景清楚，种类丰富，使用方便操作简便，繁殖快，周期短大规模生产成本低，产量高下游纯化工艺简单，生产效率高1.外源基因在原核细胞中的表达大肠杆菌基因表达载体：DNA复制及重组载体的选择系统外源目的基因的转录系统蛋白质的翻译系统二、酶的异源表达2.外源基因在真核细胞中的表达二、酶的异源表达第二节酶分子的改造遗传修饰改变酶的性能：（1）提高酶的活性（2）提高酶的稳定性（3）改变底物专一性（4）改变酶的最适pH值（5）改变酶对辅酶的要求（6）改变酶的别构调节能力酶分子改造的主要方法：

酶的定点突变

酶分子定向进化第二节酶分子的改造一、酶的定点突变

1.定义：在酶基因的特定位点引入突变，即通过取代、插入或删除已知DNA序列中特定的核苷酸序列来改变酶蛋白结构中某个或某些特定的氨基酸，从而改变酶的性质。酶分子的理性设计：利用定点突变技术有目的地在已知DNA序列中取代、插入或删除特定的核苷特点：突变率高、重复性好、简单易行2.酶定点突变的方法寡核苷酸定点突变：用含有突变碱基的寡核苷酸片段做引物，在体外以原基因序列为模板进行复制基于PCR的定点突变：重组PCR法、重叠延伸突变、大引物定点突变法盒式突变：利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。一、酶的定点突变

二、酶分子定向进化1.定义：模拟天然酶的自然进化机制，在体外对酶基因进行改造，产生基因多样性，再通过定向筛选（选择）获取具有特定性质的突变酶的过程或技术。酶分子的非理性设计：人为模拟自然进化机制，利用随机突变和定向筛选技术，获得具有某些预期特征的进化酶。2018年诺贝尔化学奖一半授予美国科学家FrancesH.Arnold，表彰她对酶开展的定向进化研究FrancesH.Arnold1.在酶的DNA编码中随机引入突变；2.将突变的DNA编码插入细菌里，让细菌生产带有不同突变的酶；3.人为设定一个筛选标准，保留满足设定标准的酶突变体，淘汰不满足标准的酶突变体；4.对保留下来的酶突变体再进行下一轮的随机突变，如此反复循环，找到最适应筛选标准的酶突变体。Arnold改造的第一个酶

——枯草杆菌蛋白酶这种酶能够切割降解其他蛋白质，但它只在水溶液中发挥功能，在有机试剂中活力极低1993年，经过三轮“随机突变-筛选”循环，Arnold找到一个突变体，在化工产业常用的有机溶剂（DMF）里的活力比它初始的模版提升了256倍。这个突变体包含了10多个位点的突变，其中很多并不是酶的催化活性位点或者底物结合“口袋”，用传统的学院派策略恐怕很难找到这种排列组合。这是酶定向进化第一次展示它的力量。2013年过世的荷兰科学家WillemP.C.Stemmer建立的DNA体外同源重组技术（DNAshuffling）对定向进化的效率提高也有重大贡献。二、酶分子定向进化二、酶分子定向进化二、酶分子定向进化2.酶分子定向进化的方法①通过随机突变和体外重组创造基因多样性；②导入适当载体构建突变文库；③通过灵敏的筛选方法，选择阳性突变子。随机突变：易错PCR、定点饱和突变等基因重组：DNA改组、外显子改组等

筛选策略底物显色反应改变培养条件利用蛋白固有性质高通量筛选二、酶分子定向进化讨论：定向进化与定点突变在突变位点、突变效应、突变方法等方面的异同之处？定向进化：突变+筛选

突变位点随机；突变位点的数目不确定；突变效应不可预知；凡能引起突变的因素（物理/化学/生物）都可应用于突变体的产生。定点突变：突变位点确定，突变位点个数可预知；突变效应可能已知，也可能未知；突变方法一般以PCR技术为基础。第三节融合酶融合酶：将两个或多个酶分子组合在一起所形成的融合蛋白融合酶的生产途径①非理性设计：先构建库，再筛选所需融合体②理性设计：在了解蛋白质的结构与功能的基础上，有针对性地进行蛋白质之间的交换和融合融合酶的构建策略二级结构融合功能域融合整个酶蛋白的融合融合酶的应用（略）第三节融合酶四、抗体酶（abzyme）P123抗体酶的发现1984年，Lerner和Schultz分别领导各自的研究小组独立地证明了：针对羧酸酯水解的过渡态类似物产生的抗体，能催化相应的羧酸酯和碳酸酯的水解反应。1986年，Science同时发表了他们的发现，并将这类具催化能力的免疫球蛋白称为抗体酶或催化抗体。1.抗体酶的概念与特点抗体酶/催化抗体（abzyme/catalyticantibody）利用酶反应中底物过渡态类似物作为半抗原刺激免疫系统所产生的具有识别和催化相应底物能力的单克隆抗体，本质上是一类具有催化活性的免疫球蛋白。

思路：以过渡态类似物作为半抗原，诱导与其互

补构象的抗体，使其具有催化活性。

方法：化学修饰法/稳定过渡态法/蛋白质工程法/抗体库法2.抗体酶的制备方法3.抗体酶的应用抗体介导前药治疗(antibody-directedenzymeprodrugtherapy,

ADEPT)：

①体内注射能与肿瘤组织特异性结合的抗体酶②当其结合到靶部位后，再注入前药③当药物扩散至肿瘤细胞表面或附近时，抗体酶可快速将其水解并释放出抗肿瘤药物，从而提高局部药物浓度，实现靶向治疗。4.抗体酶的发展前景待解决问题催化效率抗体酶筛选抗体酶专一性底物抑制催化基团的最适装配五、核酶（ribozyme）(一)核酶的发现(一)核酶的发现上世纪80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的ThomasCech和美国耶鲁大学的SidneryAltman各自独立地发现RNA具有生物催化功能，从而改变了生物催化剂的传统概念。T.Cech和S.Altman共同获得了1989年度诺贝尔化学奖。T.Cech的研究工作S.Altman的研究工作S.Altman的研究工作启示：T.Cech为什么能发现RNA的催化作用并获得诺贝尔奖？如果你是一个不为常识所束缚的人，那么，你有可能获诺贝尔奖S.Altman为什么能发现RNA的催化作用并获得诺贝尔奖？如果你能根据别人刚刚发表的成果马上修正自己的研究工作，那么，你有可能获诺贝尔奖。认真做实验认真看文献1.核酶：具有生物催化功能的RNA。生物催化剂（Biocatalyst）蛋白质类：天然酶

enzyme

极端酶extremozyme

抗体酶abzyme

生物工程酶其它：模拟酶modelenzyme

核酸类:核酶ribozyme脱氧核酶deoxyribozyme（二）核酶的概念和分类内切核酸酶+连接酶

Ⅰ型内含子四膜虫rRNA剪接型核酶Ⅱ型内含子某些真核生物的线粒体

和叶绿体rRNA

Ⅲ型内含子pre-mRNA

2.核酶的分类2.核酶的分类

锤头核酶剪切型核酶发夹核酶丁型肝炎病毒（HDV）核酶RNaseP

RNA切割（三）核酶在医药领域的应用1.核酶治疗疾病的原理2.核酶的给药途径外源性给药：直接将抗核酸酶降解的核酸注射到组织或细胞内。内源性给药：利用基因疗法，借助逆转录病毒载体和腺伴随病毒运送核酶2.

核酶的给药途径3.核酶在医学上的应用Flexizyme——PeptiDream多肽文库建立：能够将400多种不同的氨基酸与tRNA任意组合，合成几乎任何想要