基因工程基本原理及操作程序

基因工程基本原理及操作程序现在是1页\一共有40页\编辑于星期三基因工程的概念

基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向的改造生物的遗传性状。现在是2页\一共有40页\编辑于星期三苏云金杆菌毒蛋白基因毒蛋白杀死害虫棉花细胞抗虫棉的培育现在是3页\一共有40页\编辑于星期三基因工程的概念

基因工程又叫基因拼接技术或DNA重组技术。通俗的说就是按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向的改造生物的遗传性状。现在是4页\一共有40页\编辑于星期三DNA片段的连接工具（“分子缝合针”）

——DNA连接酶基因转移工具（“分子运输车”）

——运载体一、DNA重组技术的基本工具准确切割DNA的工具（“分子手术刀”）

——限制酶现在是5页\一共有40页\编辑于星期三

特点：一种限制酶只能识别DNA的一种核苷酸序列，并在特定的位点切割DNA.1、限制酶现在是6页\一共有40页\编辑于星期三限制性内切酶限制酶现在是7页\一共有40页\编辑于星期三限制酶切割的是么？DNA分子

切割DNA分子两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。现在是8页\一共有40页\编辑于星期三切割DNA分子后形成什么？黏性末端（在中轴线两侧切割DNA）平末端（在中轴线处切割DNA）现在是9页\一共有40页\编辑于星期三

会产生互补的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的DNA分子了。

如果把两种来源不同的DNA用同一种限制酶来切割，会怎样呢？现在是10页\一共有40页\编辑于星期三现在是11页\一共有40页\编辑于星期三

将双链DNA分子片段“缝合”起来，恢复两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。DNA连接酶连接的是什么？2、DNA连接酶现在是12页\一共有40页\编辑于星期三AATTGCCTTAAG磷酸二酯键磷酸二酯键现在是13页\一共有40页\编辑于星期三基因的针线：DNA连接酶

G

AA

TT

CC

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AA

GG

AA

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CC

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GGC

TT

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AA

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GGC

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G剪刀：用同种限制酶切割现在是14页\一共有40页\编辑于星期三DNA连接酶的种类T4

DNA连接酶：连接黏性末端和平末端E·coliDNA连接酶：黏性末端现在是15页\一共有40页\编辑于星期三3、运载体

常用的运载体：质粒、噬菌体和动植物病毒等标记基因，便于进行检测。

质粒存在于许多细菌和酵母菌等生物中,是拟核或细胞核外能够自主复制的很小的环状DNA分子.

现在是16页\一共有40页\编辑于星期三特点：

1.结构简单，能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。

2.具多种限制酶的单一切点，以便与外源基因连接。

3.具有某些标记基因，便于进行筛选。

4.对宿主细胞没有伤害。作用：将目的基因导入受体细胞常用运载体：质粒

动植物病毒噬菌体现在是17页\一共有40页\编辑于星期三基因工程基本操作的四个步骤1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将表达载体导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定现在是18页\一共有40页\编辑于星期三一、目的基因的获取1、目的基因主要是编码蛋白质的基因2、获取目的基因的常用方法?①从基因文库中获取②利用PCR技术扩增③人工合成现在是19页\一共有40页\编辑于星期三①从基因文库中获取目的基因基因文库

将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）现在是20页\一共有40页\编辑于星期三基因组文库

通过对受体菌群体的培养而储存一种生物的全部基因。现在是21页\一共有40页\编辑于星期三cDNA文库的构建提取生物某发育时期mRNA单链DNA逆转录酶双链的cDNA(只含该生物的部分基因)与载体连接导入受体菌群储存起来现在是22页\一共有40页\编辑于星期三基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较现在是23页\一共有40页\编辑于星期三真核细胞的基因结构编码区非编码区非编码区RNA聚合酶的结合位点内含子外显子能转录翻译成蛋白质不能转录翻译成蛋白质启动子终止子内含子：外显子：现在是24页\一共有40页\编辑于星期三基因组文库和cDNA文库的比较现在是25页\一共有40页\编辑于星期三②利用PCR技术扩增目的基因③人工合成法：

基因较小，核苷酸序列已知，可以利用DNA合成仪人工合成。现在是26页\一共有40页\编辑于星期三目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。质粒

目的基因

启动子

终止子二、基因表达载体的构建现在是27页\一共有40页\编辑于星期三启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录标记基因：为了鉴别受体细胞中是否导入了目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来现在是28页\一共有40页\编辑于星期三①用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出____________。②用_____________切断目的基因，使其产生____________③将切下的目的基因片段插入质粒的________处，再加入适量_______________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口DNA连接酶

用同种限制酶分别切割目的基因和质粒，使之露出相同的粘性末端，再加入DNA连接酶。现在是29页\一共有40页\编辑于星期三三、将目的基因导入受体细胞转化

方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法目的基因进入受体细胞内，并在受体细胞内维持稳定和表达的过程。——Ca

处理细胞

2+现在是30页\一共有40页\编辑于星期三农杆菌转化法农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力。原理：Ti质粒上的T—DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。现在是31页\一共有40页\编辑于星期三基因枪法：单子叶植物花粉管通道法：抗虫棉现在是32页\一共有40页\编辑于星期三

目的基因表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射转基因受精卵转基因动物显微注射法现在是33页\一共有40页\编辑于星期三显微注射法现在是34页\一共有40页\编辑于星期三

用Ca2+处理细胞感受态细胞表达载体与感受态细胞混合感受态细胞吸收DNA分子将目的基因导入微生物细胞现在是35页\一共有40页\编辑于星期三四、目的基因的检测与鉴定四环素抗性基因

青霉素抗性基因大肠杆菌现在是36页\一共有40页\编辑于星期三四、目的基因的检测与鉴定分子水平检测个体水平鉴定①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质方法——DNA分子杂交方法——抗原-抗体杂交抗虫鉴定、抗病鉴定等方法——DNA分子杂交现在是37页\一共有40页\编辑于星期三

DNA分子杂交原理：互补的DNA单链能够在一定条件下结合成双链，即能够进行杂交。这种结合是特异的，即严格按照碱基互补配对进行。因此，当用探针和转基因生物的DNA杂交时候，如果出现杂交带（用特殊的显影装置可以看见），则说明目的基因已插入受体细胞的染色体DNA中。

基因探针：是一小段单链的DNA或RNA，带有放射性同位素标记，并能与目的基因的的一条链发生碱基互补配对。现在是38页\一共有40页\编辑于星期三现在是39页\一共有40页\编辑于星期三②检测目的基因是否转录出了mRNA方法——DNA与mRNA杂交③检测目的基因