医学分子生物学基因结构与表达分析方法

医学分子生物学基因结构与表达分析方法第1页，共93页，2023年，2月20日，星期四第一节DNA序列分析一、双脱氧末端终止法二、化学降解法三、DNA自动化序列分析四、新一代DNA测序分析第2页，共93页，2023年，2月20日，星期四一、双脱氧末端终止法DNA合成反应第3页，共93页，2023年，2月20日，星期四ATP、dATP和ddATP的结构第4页，共93页，2023年，2月20日，星期四第5页，共93页，2023年，2月20日，星期四1.双脱氧末端终止法原理DNA合成反应中，ddNTP不存在3’-OH末端，故不能与下一个核苷酸的5’-P端形成3’,5’-磷酸二酯键，导致DNA新链的延伸提前终止于ddNTP.第6页，共93页，2023年，2月20日，星期四DNA测序技术基础高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegelelectrophoresis,PAGE)能分离长度为300-500bp，差别仅1个碱基的单链寡核苷酸片段7第7页，共93页，2023年，2月20日，星期四ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTPAGCT5′T4711GAATGA3′ACGCT8第8页，共93页，2023年，2月20日，星期四2.DNA测序主要步骤

单链DNA模板的制备DNA模板与测序引物退火

掺入法标记反应（如：α-35S）

延伸-终止反应

变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

放射自显影

阅读测序结果第9页，共93页，2023年，2月20日，星期四第10页，共93页，2023年，2月20日，星期四二、化学降解法

将待测DNA片段3’或5’端进行同位素标记，标记的DNA片段分成四个反应，分别用不同的化学试剂处理，造成碱基特异性切割，使DNA片段分别于某一种碱基处断裂。第11页，共93页，2023年，2月20日，星期四第12页，共93页，2023年，2月20日，星期四ddCTPddATPddTTPddGTPdCTPdATPdTTPdGTP三、DNA自动化序列分析

利用双脱氧末端终止法的原理13第13页，共93页，2023年，2月20日，星期四用荧光化合物分别标记4种ddNTP终止反应产物，替代放射性同位素标记是实现DNA测序自动化的基础。第14页，共93页，2023年，2月20日，星期四DNA自动测序步骤4种有不同荧光燃料标记的ddNTPsSanger测序反应反应产物毛细管电泳分离激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子，发射出四种不同波长的荧光荧光信号采集，计算机分析与DNA自动排序第15页，共93页，2023年，2月20日，星期四DyelabeleddideoxyterminatorsonABI3730capillaries第16页，共93页，2023年，2月20日，星期四四、新一代DNA测序技术

基于循环芯片测序法

高通量、测序成本低

焦磷酸测序法SOLiD分析系统：准确度最高Illumina测序仪第17页，共93页，2023年，2月20日，星期四第二节核酸分子杂交（NucleicAcidHybridization）一、核酸分子杂交原理二、Southern印迹杂交三、Northern印迹杂交四、斑点杂交五、原位分子杂交六、液相杂交第18页，共93页，2023年，2月20日，星期四一、核酸分子杂交原理

指两条互补单链核酸在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。

杂交双方是探针与待测核酸序列。探针+待测核酸

杂交双链第19页，共93页，2023年，2月20日，星期四（一）印迹技术

利用各种物理方法使电泳中的生物大分子转移到硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙膜、化学活化膜、滤纸等各种膜上，使之成为固化分子。（二）探针标记技术

用放射性同位素、生物素或荧光染料标记序列已知的多聚核苷酸链称为探针。第20页，共93页，2023年，2月20日，星期四二、Southern印迹杂交（Southern

blotting）将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。

用于DNA定性定量分析，基因突变分析，及RFLP分析等第21页，共93页，2023年，2月20日，星期四提取DNA限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳碱变性转移到NC膜，高温烘烤与DNA或RNA探针杂交放射自显影Southern印迹杂交

检测靶分子为DNA,检测靶分子是否含有目的基因。

预杂交第22页，共93页，2023年，2月20日，星期四三、Northern印迹杂交（Northern

blotting）将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及大小。

用于mRNA定性和定量分析，即基因表达分析。第23页，共93页，2023年，2月20日，星期四第24页，共93页，2023年，2月20日，星期四优点：简单、迅速可在同一张膜上进行多个样品的检测核酸粗提样品的检测效果也较好四、斑点杂交第25页，共93页，2023年，2月20日，星期四五、原位杂交insituhybridization用于核酸定性、定位分析。

菌落原位杂交

荧光原位杂交第26页，共93页，2023年，2月20日，星期四核酸杂交分类表杂交方法适用范围Southern印迹检测经凝胶电泳分开的DNA分子，需转印到膜上Northern印迹检测经凝胶电泳分开的RNA分子，需转印到膜上斑点印迹杂交检测未经分离的、固定在膜上的DNA或RNA分子原位杂交检测细胞或组织中的DNA或RNA分子第27页，共93页，2023年，2月20日，星期四与固相杂交的区别：直接在液体中杂交，不用纯化或固定靶分子，杂交步骤更简化，杂交速度有所提高，反应的敏感性和特异性更强。1．核酸酶S1保护分析法

2．RNA酶保护分析法六、液相杂交技术第28页，共93页，2023年，2月20日，星期四

利用M13噬菌体合成放射性的ssDNA探针。探针与待测RNA样品在液相中进行杂交，形成DNA/RNA。核酸酶S1能专一性地降解未形成杂交的DNA和RNA单链，不降解DNA/RNA双链。

还可用于基因转录起始点分析、内含子剪切位点分析。

1．核酸酶S1保护分析法（nucleaseS1protectionassay）第29页，共93页，2023年，2月20日，星期四目的：检测RNA，可用于mRNA的定量分析，比Northern杂交灵敏度更高。原理：探针为ssRNA，杂交后形成RNA/RNA，RNA酶A和T1专一性地降解ssRNA，而dsRNA不被降解。2．RNA酶保护分析法（RPA)第30页，共93页，2023年，2月20日，星期四第三节聚合酶链式反应

（PolymeraseChainReaction，PCR）一、PCR技术原理

二、耐热DNA聚合酶

三、PCR引物设计原则

四、PCR条件的优化

五、PCR改进技术第31页，共93页，2023年，2月20日，星期四聚合酶链式反应(PCR):一、PCR技术原理

MullisK.

1985年发明的一种模拟天然DNA复制过程的核酸体外扩增技术。

TheNobelPrizeinChemistry1993第32页，共93页，2023年，2月20日，星期四1.PCR循环由三步组成：①变性（denaturation）：93~98℃②退火(annealing)：37~65℃③延伸(extension)：70~75℃第33页，共93页，2023年，2月20日，星期四5Primer15Primer2Cycle2Cycle15555

5

5TemplateDNA55555555反应步骤示意图第34页，共93页，2023年，2月20日，星期四Cycle355

5555555

5

55555

525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。第35页，共93页，2023年，2月20日，星期四第36页，共93页，2023年，2月20日，星期四2.PCR扩增终产物大小:介于两条退火引物5′末端之间的双链DNA片段。循环一第37页，共93页，2023年，2月20日，星期四循环二第38页，共93页，2023年，2月20日，星期四循环三一对引物：正向和反向

限制了PCR扩增的片段的范围第39页，共93页，2023年，2月20日，星期四

5′CAGTTAAGGGGGCAGGAGTGGCGCTGCTCACCTCTGGTGCCAAAGGGCGGCGCAGCGGCTGCCGAGCTCGGCCCTGGAGGCGGC

AGAACATGGTGCGCAGGTTCTTGGTGACCCTCCGGATTCGGCGCGCGTGCGGCCCGCCGCGAGTGAGGGTTTTCGTGGTTCACATCCCGCGGCTCACGGGGGAGTGGGCAGCGCCAGGGGCGCCCGCCGCTGTGGCCCTCGTGCTGATGCTACTGAGGAGCCAGCGTCTAGGGCAGCAGCCGCTTCCTAGAAGACCAGGTCATGATGATGGGCAGCGCCCG

AGTGGCGGAGCTGCTGCTGCTCCACGGCGC3′GGTCCAGTACTACTACCCGTAGAACATGGTGCGCAGGTT

3.引物设计实例第40页，共93页，2023年，2月20日，星期四Y=A（1+E）n

Y:扩增产物的量

A:最初靶DNA分子数

E:PCR扩增效率

n:循环次数

4.PCR产量

当E＝100％,A=1时Y=2n>>2n(引物延伸产物的量）第41页，共93页，2023年，2月20日，星期四PCRthermalcycler第42页，共93页，2023年，2月20日，星期四PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析500bp400bp200bp300bp1000bp600bp700bp800bp900bpMarkerPCR产物第43页，共93页，2023年，2月20日，星期四5.平台期与平台效应PCR经过一定数量的循环后，DNA片段不再呈指数累积，而是进入线性增长期或静止期，即平台效应。影响因素：①引物及dNTP底物浓度降低。②酶与模板比例下降。第44页，共93页，2023年，2月20日，星期四PCR平台效应实际应用提示：

定量PCR应考虑平台期效应，选择最适循环次数。第45页，共93页，2023年，2月20日，星期四二、耐热DNA聚合酶1.TaqDNA聚合酶（实现了PCR自动化）●95℃的半衰期:40min●最适温度:72℃～80℃●催化反应速率:150～300核苷酸/秒/酶分子第46页，共93页，2023年，2月20日，星期四第47页，共93页，2023年，2月20日，星期四TaqDNA聚合酶特性：●5′→3′聚合酶活性；●5′→3′外切酶活性；

逆转录酶活性；●较弱的非模板依赖性；●缺乏3′→5′外切酶活性，无校正功能。第48页，共93页，2023年，2月20日，星期四2.无机离子及抑制剂的影响

TaqDNA聚合酶的活性对Mg2+浓度和单价离子（K+或NH4+）的性质和浓度较敏感。最适Mg2+浓度：2mmol/LK+浓度：50mmol/L第49页，共93页，2023年，2月20日，星期四如何提高PCRDNA聚合酶的保真性？（1）使用TaqDNA聚合酶时，掺入少量具有3′→5′外切酶活性的耐热DNA聚合酶，错配率可降为原来的1/10。（2）使四种dNTP底物浓度相等；（3）MgCl2浓度尽可能低；（4）减少循环数。第50页，共93页，2023年，2月20日，星期四3.几种高保真的耐热DNA聚合酶TthDNA聚合酶VentDNA聚合酶PfuDNA聚合酶第51页，共93页，2023年，2月20日，星期四三、PCR引物设计原则引物设计是决定PCR特异性扩增的关键。第52页，共93页，2023年，2月20日，星期四PCR引物设计原则：1.引物与模板的序列紧密互补2.引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构3.引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(错配)第53页，共93页，2023年，2月20日，星期四5′CACTGAACGTAGGCCT3′

3′GCAGGTTCAGTGACTTGCATCCGGATGCAAC5′特异扩增5′CACTGAACGTAGGCCT3′3′GGATCTACATGCGACTTAATCCGGAGATACC5′错误引发

引物与模板的序列要紧密互补引物不能在模板的非目的位点引发

DNA聚合反应(错配)第54页，共93页，2023年，2月20日，星期四（1）引物之间应避免3′端互补引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构（2）引物自身不应形成发夹结构第55页，共93页，2023年，2月20日，星期四PCR引物设计原则:①引物长度:10～30nt②碱基分布:A、T、G、C随机分布③G+C含量：40～60%，Tm=4(G+C)+2(A+T)④引物之间：避免3′末端互补⑤引物自身：不应形成二级结构⑥

引物3’末端碱基：最好选T/C/G⑦5′末端碱基：可不与模板DNA互补第56页，共93页，2023年，2月20日，星期四第57页，共93页，2023年，2月20日，星期四模板引物TaqDNA聚合酶dNTPMg2+退火变性延伸PCR反应体系：四、PCR条件的优化第58页，共93页，2023年，2月20日，星期四1.TaqDNA聚合酶浓度：

1.0～2.5U/100μl反应液

2.dNTP浓度：20～200μmol/L

3.Mg2+浓度：0.5～2.5mmol/L4.引物浓度：0.1～0.5μmol/LPCR条件的优化第59页，共93页，2023年，2月20日，星期四五、PCR改进技术反转录PCR

(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)以mRNA为模板逆转录合成cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR反应。第60页，共93页，2023年，2月20日，星期四逆转录酶①AMV（avianmyeloblastosisvirus）酶活性最适温度42℃②MMLV（Moloneymurineleukemiavirus）：最适温度37℃第61页，共93页，2023年，2月20日，星期四2.定量RT-PCR（QRT-PCR）半定量RT-PCR

以样本mRNA为模板逆转录合成cDNA，在不同引物对引导下共同PCR扩增“管家”基因和目的基因cDNA。第62页，共93页，2023年，2月20日，星期四（1）选择内对照基因

组织中普遍表达、表达量比较恒定的“看家”基因mRNA。如GAPDH和β-actinmRNA等。（2）半定量标准

计算PCR产物：

靶cDNA/GAPDHcDNA第63页，共93页，2023年，2月20日，星期四（3）KPNA2在正常生理状态东方田鼠和小鼠体内表达分析第64页，共93页，2023年，2月20日，星期四第65页，共93页，2023年，2月20日，星期四3.实时荧光定量PCR

（Real-timefluorescentquantitativePCR，FQ-PCR）PCR扩增指数期内极小的扩增效率改变会极大地影响产量。应用：用于基因DNA拷贝数和mRNA表达定量分析。

第66页，共93页，2023年，2月20日，星期四67（1）SYBRGreen法SYBRGreen能结合到双链DNA的小沟部位SYBRGreen只有和双链DNA结合后才发荧光变性时，DNA双链分开，无荧光复性和延伸时，形成双链DNA，SYBRGreen发荧光，在此阶段采集荧光信号SYBRGreen第67页，共93页，2023年，2月20日，星期四第68页，共93页，2023年，2月20日，星期四69与目标序列互补（2）TaqMan法TaqMan水解型荧光标记探针探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收，无荧光，R与Q分开，发荧光Taq酶有5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针第69页，共93页，2023年，2月20日，星期四第70页，共93页，2023年，2月20日，星期四。（3）分子信标探针（MolecularBeacon,TM）该探针具有发夹结构，5′端标记荧光报告基团，3′端标记淬灭基团。第71页，共93页，2023年，2月20日，星期四探针与靶序列杂交结合，报告荧光染料与淬灭染料分离，发出荧光。第72页，共93页，2023年，2月20日，星期四（4）实时荧光定量PCR计算原理PCR扩增效率的差异使相同的样品最终产量有很大差异第73页，共93页，2023年，2月20日，星期四第74页，共93页，2023年，2月20日，星期四CT或Tc或Ct值：临界点循环（Thresholdcycle），即从基线到指数增长的拐点所对应的循环数第75页，共93页，2023年，2月20日，星期四第76页，共93页，2023年，2月20日，星期四●传染病诊断、监测与疗效预后评估：●揭示疾病发病机制第77页，共93页，2023年，2月20日，星期四荧光定量PCR仪带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，配有电脑系统及分析软件。第78页，共93页，2023年，2月20日，星期四六、其它PCR技术1.反向PCR(inversePCR)

对已知片段两侧的未知序列进行扩增和研究。第79页，共93页，2023年，2月20日，星期四2.Alu-PCR

利用Alu高度保守序列设计引物扩增哺乳动物未知DNA片段的方法。

第80页，共93页，2023年，2月20日，星期四3.原位PCR(in-situPCR)

是指直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增，然后用特异探针进行原位杂交检测含该特异序列的细胞的一种方法。第81页，共93页，2023年，2月20日，星期四4.巢式PCR（nestedPCR）

两对引物：内引物、外引物

可检出低拷贝原始模板。

第82页，共93页，2023年，2月20日，星期四5.不对称PCR（