重组疫苗EcoliLLOOVA经TLR4和NOD1受体诱解析

重组疫苗E.coliLLO/OVA

经TLR4和

NOD1受体引诱树突状细胞表达细胞因子[11-01-3009:30:00]

作者：徐曼

,

戴明燊,米

编写：studa20【纲要】目的:商讨树突状细胞(DC)的模式辨别受体(PPRs)活化与细胞因子表达的关系。方法:采纳基因芯片及RTPCR检测经E.coliLLO/OVA刺激后小鼠骨髓树突状细胞（bonemarrowderiveddendriticcell,BMDC）的PPRs及其下游NFκB信号通路有关分子mRNA的表达水平,并察看BMDC的活化情况及培育上清液内细胞因子含量。结果:经E.coliLLO/OVA刺激后2h,BMDC出现短暂的TLR4mRNA表达上浮,其下游信号门路有关的Myd88、Rip2、Irak1、Irak2、Ikkα、NFκB1和NFκB2mRNA均出现表达上浮,黏附分子Icam1、细胞因子IL1a、IL1b、IL6和TNFα的mRNA也表达上浮;经E.coliLLO/OVA刺激后4h,BMDC出现Card4(NOD1)mRNA表达上浮,其下游信号门路有关的Rip2、Ikkβ、NFκB1和NFκB2mRNA均出现表达上浮,IFNγ、TNFβ和CD40mRNA也上浮表达。经E.coliLLO/OVA刺激后24h,BMDC表达共刺激分子及MHCII类分子上浮;且培育上清液内IL12和IFNγ含量增高。结论:重组疫苗E.coliLLO/OVA经TLR4和NOD1受体激活NFκB信号通路,引诱了小鼠BMDC成熟并表达一系列细胞因子特别是IL12和IFNγ。【重点词】

骨髓树突状细胞

;

重组大肠杆菌

;

模式辨别受体

;

基因芯片［Abstract］AIM:Toinvestigatetherelationshipbetweentheactivationofpatternrecognitionreceptorsandthecytokinesexpressionofdendriticcells.METHODS:Afterbonemarrowderiveddendriticcells(BMDCs)werepulsedbyE.coliLLO/OVA,themRNAexpressionofpatternrecognitionreceptorsandthedownstreamNFBsignalpathwayassociatedmoleculesweredetectedbymicroarrayhybridizationandRTPCR;theexpressionofcostimulatorymolecules,MHCclassⅡandcytokinesweredeterminedbyflowcytometryandELISA.RESULTS:AfterBMDCswerepulsedbyE.coliLLO/OVAfor2h,thelevelsofTLR4,Myd88,Rip2,Irak1,Irak2,Ikkα,NFκB1andNFκB2mRNAupregulated;andthelevelsofIcam1,IL1a,IL1b,IL6andTNFαmRNAupregulatedalso;afterBMDCswerepulsedbyE.coliLLO/OVAfor4h,thelevelsofCard4(Nod1),Rip2,Ikkβ,NFκB1andNFκB2mRNAupregulated,meanwhile,thelevelsofTNFγ,TNFβandCD40mRNAupregulated.TheexpressionsofcostimulatorymoleculesandMHCclassⅡoftheBMDCsupregulatedandtheconcentrationofIL12andIFNγincreasedinthesupernatantofBMDCspulsedbyE.coliLLO/OVAat24h.CONCLUSION:RecombinantE.coliLLO/OVAinducesmaturationandexpressionofcytokines,especiallyIL12andIFNγ,ofmurineBMDCsthroughactivationofNFκBsignalpathwaywithTLR4andNOD1receptors.［Keywords］bonemarrowderiveddendriticcell(BMDC);recombinantE.coli;patternrecognitionreceptors(PPRs);microarray树突状细胞（dendriticcells,DC）在引诱和调理机体的获取性免疫和天然免疫中发挥了重要作用,所以肿瘤疫苗可否有效的活化DC是决定疫苗免疫成效的重点。DC能经过其模式辨别受体（patternrecognitionreceptors,PPRs）辨别病原有关模式分子而活化成熟,进而引诱天然免疫和调理获取性免疫。Toll样受体（tolllikereceptors,TLR）是最主要的PPR,当前已发现TLR1TLR13的13个TLR家族成员,它们多散布于细胞膜,且每一成员辨别独有的模式分子,如TLR2辨别革兰氏阳性菌的糖肽,而TLR4辨别革兰氏阴性菌菌壁的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）。TLR家族可经过依靠Myd88的信号门路活化NFκB介导MHCⅡ类分子和共刺激分子表达,同时也促使炎性细胞因子的分泌,别的文件还报导TLR4的活化介导了抗肿瘤免疫［1,2］。最近几年来研究发现细胞内的PPR核苷酸连结的寡聚化域（nucleotidebindingoligomerizationdomain,NOD）受体,如NOD1和NOD2受体在辨别细胞质内的分子后,也能经NFκB信号门路引诱DC产生细胞因子进而启动天然免疫,并与TLR信号门路共同引诱Th1细胞的产生［3,4］。我们采纳非致病性大肠杆菌携带模型肿瘤抗原卵白蛋白（ovalbumin,OVA）和李斯特溶素O（ListeriolysinO,LLO)建立的重组疫苗E.coliLLO/OVA体外刺激DC,用基因芯片杂交和RTPCR等方法检测E.coliLLO/OVA刺激DCTLR和NOD受体及其下游NFκB信号门路有关分子活化与细胞因子表达的关系。资料和方法1.1资料TRIzolRNA提取试剂和琼脂糖购自Invitrogen企业。Rneasy迷你柱购自Qiagen企业。TaqMan逆转录试剂盒购自Roche企业。去内毒素的PBSbuffer,RPMI1640由CancerresearchUK供给。重组鼠GMCSF购自Pepritech企业。TrulabelingAMPTMLinearRNA扩增试剂盒、OligoGEArray鼠NFκB信号通路基因芯片购自Supperarray企业。PCR引物由Sigma企业合成。FITC连结的抗鼠CD40,CD80,CD86和IAb(MHCII)荧光抗体购自BDPharmingen企业。鼠IL12和IFNγELISA试剂盒购自BDBiosciences企业。6～8周龄雌性C57BL/6小鼠,体质量20～25g,购自英国Harlan企业,于无菌环境饲养。实验前处死小鼠取其股骨和胫骨骨髓细胞,培育于RPMI1640培育液（含10mL/L小牛血清,重组小鼠GMCSF6ng/L）。培育第4天弃去悬浮细胞并改换培育液,连续培育至第7天,采集悬浮的BMDC用于实验。1.2方法细菌菌株及培育单克隆含LLO和OVA基因片段质粒的重组E.coliLLO/OVA,仅含OVA基因片段质粒的重组E.coliOVA经含选择性抗生素的LB液体培育基37℃摇床培育留宿后,加入4mmol/L的IPTG引诱LLO和OVA的合成,当培育液A600达到1时采集细菌,经Westernblot考证LLO和/或OVA的表达后,分装储藏于-80℃备用。E.coliLLO/OVA和E.coliOVA用前均用5g/L多聚甲醛室温固定30min,经去内毒素的PBS洗3次后,重悬为1012细菌/L,4℃冰箱储藏备用。BMDC的培育和细菌刺激将前述的小鼠BMDC（2×109/L）与E.coliLLO/OVA（1011/L）或E.coliOVA(1011/L)按BMDC∶细菌≈1∶5的比例混淆,于培育管内用RPMI培育液（加入100mL/L小牛血清）37℃,50mL/LCO2孵育60min;加入庆大霉素50mg/L杀灭细胞外细菌,清洗并重悬细胞于RPMI培育液（加入100mL/L小牛血清和庆大霉素50mg/L）连续培育;分别于2、4、6、8h后采集细胞用于提取RNA,24h后采集细胞及上清用于流式细胞术和ELISA检测。Supperarray探针的合成和杂交BMDC的总RNA(3μg)经逆转录后,按Supperarray企业的OligoGEArrayTrulabelingAMPTMLinearRNA扩增试剂盒说明书合成生物素标志的cRNA探针。6μg的cRNA探针与鼠NFκB信号通路基因芯片在杂交炉内60℃杂交18h,经BufferI和BufferII清洗后,加入SolutionG于杂交炉内37℃孵育40min,再加入APSABuffer孵育10min,CDPStar孵育5min后拿出芯片,在暗盒内用KODAK胶片覆盖芯片曝光10～15min并冲刷胶片;扫描仪扫描曝光后的胶片,所得图片经Superarray企业GEArrayexpression剖析软件剖析杂交结果。RTPCR分别将经E.coliLLO/OVA和E.coliOVA刺激后2,4,6,8h的BMDC提取的2μg总RNA,用TaqMan逆转录试剂于42℃,50min合成cDNA后,用PCR50μL扩增系统扩增Tlr4和Nod1(Card4)的cDNA。RTPCR中所用引物以下:Tlr4(439bp)F5′GGAAGGACTATGTGATGTGACC3′,R5′GCTCTTCTAGACCCATGAAATTGG3′;Card4/Nod1(469bp)F5′CTTGCATTCAATGGCATCTC3′,R5′ACATCGGTGTGCACTGTGGA3′;Gapdh(496bp)F5′TGATGGGTGTGAACCACGAG3′,R5′TCAGTGTAGCCCAAGATGCC3′。反响系统扩增条件以下:于94℃变性5min后,94℃变性45s、55℃复性45s、72℃延长45s共30个循环,最后72℃再延长10min。于12g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增条带。细胞因子检测按试剂盒操作说明向测定板孔内分别加入50μLIL12或IFNγ标准、控制液和BMDC培育上清液,于室温孵育2h并用Buffer清洗5次后,加入100μL连结反响液于室温孵育2h并清洗5次后,加入显色反响液室温避光孵育30min;停止反响后在酶标仪上测定A450值。细胞表面分子检测分别采集E.coliLLO/OVA或E.coliOVA刺激24h后的BMDC,将细胞密度调整为1×105细胞/80μL,分别加入FITC连结的抗CD40、CD80、CD86和MHCII(IAb)抗体,4℃避光孵育30min;FACSBuffer

洗3次后重悬细胞进行流式细胞术检测。统计学剖析采纳SAS8.0学剖析,P<0.05拥有统计学意义。

软件

student

’s

ttest

进行统计结果2.1重组疫苗E.coliLLO/OVA经TLR4和Card4（NOD1）活化BMDC小鼠NFκB基因芯片杂交结果显示经E.coliLLO/OVA刺激后2h,BMDC出现短暂的TLR4mRNA表达上浮,其下游信号门路有关的Myd88、Rip2、Irak1、Irak2、Ikkα、NFκB1和NFκB2mRNA均出现表达上浮,黏附分子Icam1、细胞因子IL1a、IL1b、IL6和TNFα的mRNA也出现表达上浮;经E.coliLLO/OVA刺激后4h,BMDC出现Card4（NOD1）mRNA及其下游信号门路有关的Rip2、Ikkα、Ikkβ、NFκB1和NFκB2mRNA表达上浮,同时IFNγ、Lta(TNFβ)和TNFsf5(CD40)mRNA也表达上浮（图1）。RTPCR结果也证明BMDC在受E.coliLLO/OVA刺激后2h出现TLR4mRNA表达上浮,且表达水平略高于E.coliOVA刺激的BMDC;BMDC经E.coliLLO/OVA刺激后4～8hNOD1(Card4)mRNA连续表达上浮,而BMDC仅在被E.coliOVA刺激6h后出现Nod1(Card4)mRNA表达上浮（图2）。图1BMDC经E.coliLLO/OVA刺激后的基因表达（略）Fig1ThemRNAexpressionofmurineBMDCpulsedbyE.coliLLO/OVA2.2BMDC上浮表达共刺激分子和MHCII类分子刺激后24h,BMDC上浮表达共刺激分子CD40、CD80、

在E.coliLLO/OVACD86及MHCⅡ类分子,特别CD40显然表达上浮。但E.coliLLO/OVA与E.coliOVA刺激的BMDC共刺激分子和MHCⅡ类分子表达差异无统计学意义（图3）。图2RTPCR检测BMDC的TLR4和Nod1mRNA表达（略）Fig2TLR4andNod1mRNAexpressionofmurineBMDCdeterminatedbyRTPCR1:NaveBMDC;2-5BMDCpulsedbyE.coliLLO/OVA2,4,6,8h;6-9:BMDCpulsedbyE.coliOV