第一章-植物工厂化育苗的工厂与设备

第一节实验室一、实验室植物组织培养是在严格无菌的条件下进行的。要做到无菌的条件，需要一定的设备、器材和用具，同时还需要人工控制温度、光照、湿度等培养条件。

实验室设计原则：保证无菌操作，达到工作方便，防止污染。1当前1页，总共84页。准备室培养室温室Text实验室接种室接种室实验室组成：当前2页，总共84页。基本实验室布局平面图实验台搁架培养架培养架培养架培养架药品及仪器柜无菌台无菌台搁架拉窗冰箱搁架水槽电炉门4.5m3.0m3.5m4.0m准备室缓冲室无菌室培养室3当前3页，总共84页。准备实验室4当前4页，总共84页。缓冲室5当前5页，总共84页。无菌室6当前6页，总共84页。无菌室7当前7页，总共84页。8无菌室8当前8页，总共84页。99当前9页，总共84页。10培养架10当前10页，总共84页。11培养室11当前11页，总共84页。温室12当前12页，总共84页。1313当前13页，总共84页。第二节仪器与设备14当前14页，总共84页。冰箱酸度计电炉1.基本设备当前15页，总共84页。16当前16页，总共84页。天平纯水器17当前17页，总共84页。搅拌器18当前18页，总共84页。蒸汽压力灭菌锅2.灭菌设备19当前19页，总共84页。20当前20页，总共84页。21过滤灭菌装置21当前21页，总共84页。22紫外灭菌灯管22当前22页，总共84页。3、无菌操作设备

超净工作台23当前23页，总共84页。24超净工作台24当前24页，总共84页。无菌接种箱25当前25页，总共84页。恒温振荡培养箱

光照培养箱4、培养设备26当前26页，总共84页。摇床27当前27页，总共84页。5、细胞学鉴定设备光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜28当前28页，总共84页。倒置显微镜光学显微镜29当前29页，总共84页。1、玻璃器皿三、培养器皿及实验用具培养皿三角瓶培养瓶当前30页，总共84页。2、金属材质用具镊子解剖刀接种针接种盘31当前31页，总共84页。32第二节培养基

培养基是决定植物组织培养成败的关键因素之一。

培养基的构成要素通常可分为：①水分；②无机盐类；③有机营养成分；④植物生长调节物质；⑤天热物质；

⑥pH；⑦凝固剂等。32当前32页，总共84页。33构成培养基的绝大部分组分为水分。在研究上，常用蒸馏水来配制培养基，而最为理想的水应该是纯水。（一）水分33当前33页，总共84页。※大量营养元素：占干物质重量的0.1%以上；

C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S等9种※微量营养元素：占干物质重量的0.1%以下有的只含0.1mg/kgFe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl等7种按照国际植物生理协会的建议：所需浓度>0.5mmol/L的元素为大量元素所需浓度<0.5mmol/L的元素为微量元素（二）矿质元素34当前34页，总共84页。1.大量元素N是蛋白质、酶、叶绿素、维生素、核酸、磷脂、生物碱等的组成成分，在植物生命活动中占有重要的位置。P是磷脂的主要成分。培养基中常用KH2PO4NaH2PO4等。

K对碳水化合物合成，转移，以及氮素代谢等有密切关系。35当前35页，总共84页。Mg、S、Ca是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，对核蛋白体结构具有稳定作用；S是含S氨基酸的蛋白质的组成成分。Ca是构成细胞壁的成分，对细胞分裂，稳定质膜结构有显著作用，此外，Ca及钙调素在细胞信号转导中起重要作用。当前36页，总共84页。2、微量元素

在微量元素中，铁的使用最大：

◆一些氧化酶的组成成分

◆叶绿素形成的必要条件

◆使用乙二胺四乙酸铁（EDTA-Fe）鳌合物防止铁的沉淀37当前37页，总共84页。

硼与蛋白质合成、糖类运输有着密切的关系

铜是某些氧化酶的成分，能够促进离体根的生长

锰参与植物的光合、呼吸代谢

钼参与氮素的代谢氯是光合作用水光解的活化剂

微量元素的主要作用是作为酶的辅助因子或激活剂参与代谢的调节。38当前38页，总共84页。（三）有机营养成分

培养基中的有机营养成分包括糖类物质、维生素类和氨基酸类。当前39页，总共84页。1.碳源

碳源物质包括糖类物质、醇类物质和有机酸，以糖类物质最重要。糖类物质特点：

◆具有热易变的性质◆利于吸收和利用

◆使用浓度一般在2%—5%

◆提供能源和调节渗透压40当前40页，总共84页。2.维生素类◆以各种辅酶的形式存在

◆参与多种代谢活动

◆对生长，分化等有很好的促进作用

◆主要分为脂溶性维生素和水溶性维生素

◆常用维生素有VB1和VB6

41当前41页，总共84页。

◆蛋白质的组成成分◆有机氮源◆可直接被细胞吸收利用◆培养基中常用的是甘氨酸

3.氨基酸42当前42页，总共84页。4.肌醇

◆环己六醇

◆细胞壁的构建材料

◆参与碳水化合物、磷脂代谢及离子平衡等生理活动

◆促进活性物质发挥作用43当前43页，总共84页。（四）植物生长调节剂

植物生长调节剂不仅可以促进植物组织的脱分化和形成愈伤组织，还可以诱导不定芽、不定胚的形成。最常用的有生长素和细胞分裂素，有时也会用到赤霉素和脱落酸。

当前44页，总共84页。1.生长素类◆促进细胞伸长和分裂

◆促进生根、抑制器官脱落、性别控制、延长休眠、顶端优势、单性结实

◆诱导愈伤组织形成

◆溶于95%酒精或0.1mol/L的NaOH中，后者的溶解效果更好

◆常用的生长素：

IAA(吲哆乙酸)NAA(萘乙酸)2,4-D(2,4，二氯苯氧乙酸)IBA(吲哆丁酸)45当前45页，总共84页。2.细胞分裂素类◆促进细胞分裂和分化

◆诱导胚状体和不定芽的形成

◆延缓组织的衰老并增强蛋白质的合成

◆用于离体成花的调控

◆溶于0.5-1.0mol/L的盐酸或稀薄的NaOH中

◆常用的细胞分裂素：

KT(激动素)BA(6-卞基腺嘌呤)2-ip(异戊烯氨基嘌呤)ZT（玉米素）46当前46页，总共84页。3.赤霉素类和脱落酸A、赤霉素类◆组织培养中不常使用◆加速细胞的伸长生长◆促进细胞的分裂◆主要是GA3B、脱落酸◆抑制细胞分裂和伸长◆促进脱落和衰老◆促进休眠和提高抗逆能力GA3脱落酸47当前47页，总共84页。

◆促进某些愈伤组织和器官的生长◆化学成分不明、复杂◆天然营养混合物如：水解酪蛋白、玉米胚乳、酵母提取物（五）天然复合物48当前48页，总共84页。

49（六）pH在灭菌前，培养基的pH一般被调节到5.0~6.0

之间，最常用的pH为5.7~5.8。pH过高时，培养基会变硬；pH过低时，则影响培养基的凝固。49当前49页，总共84页。（七）凝固剂◆琼脂是使用最普遍的凝固剂◆用量一般在6-10g/L之间◆颜色以浅、透明度高好，洁净为上品除了琼脂外，在组织培养中还可以使用琼脂糖、结冷胶等。50当前50页，总共84页。（八）其他添加物1.活性炭◆吸附培养基及培养物分泌物中的抑制物质

◆抑制外植体褐变

◆防止玻璃苗的产生

◆促进培养物生长和分化

◆促进生根2.抗生素

◆防止外植体内生菌造成的污染活性炭51当前51页，总共84页。52二、培养基的基本类型◆培养基形态不同：固体培养基、液体培养基◆培养过程不同：初代培养基、继代培养基◆其作用不同：诱导培养基、增殖培养基、生根培养基

◆营养水平不同：基本培养基、完全培养基（一）培养基的种类◆成分和浓度不同：含盐量较高的培养基、硝酸钾含量较高的培养基、中等无机盐含量的培养基、低无机盐含量的培养基52当前52页，总共84页。531、MS培养基◆无机盐浓度高◆高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐◆含有一定数量的铵盐◆营养丰富◆不需要添加更多的有机附加物（二）几种常见培养基的特点53当前53页，总共84页。当前54页，总共84页。2、White培养基

◆1943年由White为培养番茄根尖而设计

◆

1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素◆无机盐浓度较低◆使用广泛◆在生根培养、胚胎培养中有良好的效果大量元素含量微量元素含量铁盐含量有机物含量其他含量KNO380H3BO31.5Fe2(SO4)32.5肌醇100蔗糖30000Ca(NO3)24H2O300MnSO44H2O7.0烟酸0.3琼脂8000MgSO47H2O720ZnSO47H2O3.0盐酸硫胺素0.1

NaH2PO44H2O16.5MoO30.0001盐酸吡哆辛0.1KCl65CuSO45H2O0.001甘氨酸3Na2SO4200附表：White培养基55当前55页，总共84页。3、B5培养基◆1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计◆含有较低的铵盐◆较高的硝酸盐和盐酸硫胺素组成成分数量(mg/l）组成成分数量(mg/l)KNO3

2500FeSO4·7H2O27.8CaCl2·2H2O150CuSO4·5H2O0.025MgSO4·7H2O250蔗糖40(NH4)2SO4134pH5.5KI0.75肌醇100H3BO43.0烟酸1.0MnSO4·4H2O10盐酸吡哆醇1.0ZnSO4·7H2O2.0激动素0.1Na2MoO4·2H2O0.252,4－D0.1－1.0CoCl2·6H2O0.025盐酸硫铵10Na2-EDTA37.3

B5培养基的组成和配方56当前56页，总共84页。4、N6培养基

◆1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计

◆

KNO3和(NH4)2SO4含量高，不含钼组成成分数量(mg/l)组成成分(mg/l)KNO3

2.3Na2－EDTA37.3CaCl2·2H2O166FeSO4·7H2O27.8MgSO4·7H2O185蔗糖50KH2PO4

400pH5.8(NH4)2SO4

463烟酸0.5KI0.8盐酸吡哆醇0.5H3BO31.6甘氨酸2.0MnSO4·4H2O4.4盐酸硫铵1.0ZnSO4·7H2O1.5N6培养基组成及配方57当前57页，总共84页。第三章培养基和培养条件当前58页，总共84页。为了减少工作量，减小误差，最方便的方法是预先配制好不同组分的培养基母液。一、培养基母液的配制

59当前59页，总共84页。1.配制母液原则

相同类型的试剂混合；易形成沉淀的药品分开；母液浓度要适宜；用量要认真计算和核对；药品要准确称量。60当前60页，总共84页。

2.MS培养基母液的配制

MS培养基母液根据试剂特性通常配成五种母液，即大量元素母液（10或20倍）、微量元素母液（100或1000倍）、Fe盐（100倍）、Ca盐（50倍）、有机物（100倍）。

61当前61页，总共84页。62当前62页，总共84页。3.激素母液的配制

生长素类、赤霉素类及脱落酸等用95％乙醇溶解；细胞分裂素类用1NHCl或1NNaOH溶解。

通常激素母液浓度生长素类为0.1~0.5mg/ml,细胞分裂素母液浓度为0.2~1.0mg/ml.63当前63页，总共84页。二、培养基的配制水药品糖琼脂混合加热溶解调整pH玻璃器皿水洗干燥分装灭菌封口冷却接种当前64页，总共84页。1、取出母液并按顺序放好。将洁净的各种玻璃器皿如量筒、容量瓶、移液管、移液枪和玻璃棒等放在指定位置；2、取一只容量瓶，放入配制培养基总量的1/3左右纯水，将母液按顺序加入，并不断搅拌；3、加入植物生长调节剂后定容；培养基的配制的具体步骤：当前65页，总共84页。4、将定容的培养基倒入容器中，加入蔗糖和琼脂，并加热使其完全溶解；5、调整pH；6、将培养基分装倒培养器皿中，封好瓶口；7、灭菌，用高压锅灭菌（121℃，15～20min）或过滤除菌；8、灭菌后待高压锅温度下降到50℃以下时，便可以取出、冷却凝固后待用。当前66页，总共84页。67当前67页，总共84页。68当前68页，总共84页。三、培养基的保存

配制好的培养基一般要在室温、黑暗且清洁的地方放置3～5天再使用。

保存时间太久，培养基可能会污染、脱水、易分解的成分会发生分解，培养基成分会发生较大的变化。

每批培养基均必须附有该批培养基制备记录副页或明显标签。当前69页，总共84页。四、培养条件温度光照湿度气体培养基的渗透压pH值植物材料一般最适温度在25±2℃之间环境条件光强：1000~6000lx一般情况下，培养器内相对湿度应达100%，培养室内环境的相对湿度在70%~80%氧气是愈伤组织生长所必需的调节渗透压常常从糖入手植物组织培养时培养基的pH值大多在5.0－6.5光质：影响细胞分裂和器官分化光周期：光照16h，黑暗8h70当前70页，总共84页。第三节基本操作一、洗涤1、玻璃器皿洗涤新购置玻璃器皿1%稀HCl浸渍12h洗衣粉洗涤清水冲洗晾干备用已用过的玻璃器皿当前71页，总共84页。2、塑料用品洗涤塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水冲洗2%—5%盐酸浸泡30min清水冲洗蒸馏水冲洗晾干备用72当前72页，总共84页。3、金属用品洗涤热洗衣粉水洗净冲洗擦干73当前73页，总共84页。1.灭菌方法：（1）物理方法：物理灭菌干热、湿热、射线处理、物理除菌、过滤、离心、沉淀等（2）化学方法：消毒剂、抗菌素灭菌

74二、消毒灭菌74当前74页，总共84页。2、灭菌（1）培养基灭菌：高温高压湿热灭菌法压力在9.8×104—10.8×104Pa

温度在121℃

灭菌20—30min（2）玻璃器皿灭菌：蒸汽高压消毒灭菌干热消毒灭菌75当前75页，总共84页。饱和蒸汽压力与其对应的温度饱和蒸汽压力温度（℃）饱和蒸汽压力温度（℃）kg/cm21b/m2kg/cm21b/m20.00.1410.2810.4420.5630.7030.8440.98402468101214100103.6106.9109.8112.6115.2117.6119.91.0001.0551.1251.2661.4061.5431.6811516182022243050121.0122.0124.1126.0127.8129.6134.5147.676当前76页，总共84页。（3）塑料器皿灭菌：多采用高压蒸汽消毒灭菌（4）金属用具灭菌：灼烧灭菌浸入95%酒精，后置于酒精火焰上灼烧，冷却后使用（5）过滤灭菌：一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素。77当前77页，总共84页。（6）接种室灭菌