凋亡相关基因Bax表达产物的检测

凋亡相关基因Bax表达产物的检测第1页/共18页

实验原理免疫细胞化学（免疫组化）是将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有的特殊标记物的显示，籍以对细胞内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检测。

第2页/共18页链霉亲和素—生物素—过氧化酶复合物技术（SABC技术）其特点是利用链霉亲和素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。链霉亲和素对生物分子有极高的亲和力，是一般抗原抗体亲和力的一百万倍，其对组织和细胞的非特异吸附很低，该方法背景很低。SABC大约可以形成一百万个左右的过氧化物酶和五十个左右的链霉亲和素所构成的复合物SABC具有很高的敏感性、低背景和操作简便的优点。第3页/共18页SABC(avidin-biotin-peroxidasecomplex)antigen第4页/共18页器材与试剂

仪器：移液枪、枪头、滴管、显微镜、湿盒材料：培养细胞试剂：甲醇、PBS、封闭液、一抗、二抗、

SABC、DAB、0.3％H2O2-PBSDMEM培养液（10%小牛血清的高糖、无糖）顺铂（20、40umol/l）第5页/共18页

试剂说明PBS：磷酸盐缓冲液（0.01M，PH7.2）封闭液：5%牛血清白蛋白（BSA，即用型）一抗：小鼠IgG（抗小鼠、抗大鼠、抗人），用时PBS稀释二抗：山羊抗小鼠IgG(生物素化)SABC(avidin-biotin-peroxidasecomplex)：链酶亲和素—生物素—过氧化物酶复合物

DAB(diaminobenzidine)显色液试剂盒：（3,3´-二氨基联苯胺、TBS、H2O2）第6页/共18页课前操作周二下午接种细胞96孔板（每组8孔）正常、缺糖损伤、两浓度药物损伤各2孔周三中午损伤（6孔）周四中午固定、加封闭液（正常、缺糖损伤、两浓度药物损伤各1孔，共4孔），30分钟后加一抗周五中午加二抗第7页/共18页

实验步骤培养细胞（96孔板，每组正常、缺糖损伤、两个浓度药物损伤各2孔）吸弃培养液，PBS洗，3次(轻轻摇动后吸弃，小心)甲醇固定5minPBS洗，3次（同上）（加时用吸管，吸时用枪，以后同）加入封闭液25µl，37℃，30min，吸去上清液加一抗25µl，37℃，1-2h后置4℃冰箱过夜(每组各3孔)PBS洗，3次加二抗（1mlPBS加入生物素化山羊抗小鼠IgG10µl）25µl，37℃，1hPBS洗，3次第8页/共18页

实验步骤加0.3％H2O2-PBS（30-50µl），37℃，30minPBS洗，3次SABC工作液（即用型）25µl，37℃，30minPBS洗，3次DAB显色：

DAB显色工作液配制（现配）：用三蒸馏水稀释DAB显色液（20倍），混匀后加至96孔板（25-30µl/孔），镜下控制，以蒸馏水终止反应。观察结果第9页/共18页实验结果缺糖前HeLa

细胞第10页/共18页

缺糖24hHeLa细胞第11页/共18页缺糖48hHeLa

细胞第12页/共18页缺糖前PC12细胞第13页/共18页缺糖24h

PC12细胞第14页/共18页缺糖48h

PC12细胞第15页/共18页注意事项吸弃及加液时要注意不要将细胞吹起一抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度有直接关系。染色时间要控制好，及时以蒸