重组人生长激素冻干配方筛选和稳定性研究-于忠喜(完整版)实用资料

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博士、硕士专业学位名称重组人生长激素冻干配方筛选和稳定性研究_于忠喜（完整版）实用资料(可以直接使用，可编辑完整版实用资料，欢迎下载）临床医学博士兽医博士口腔医学博士法律硕士教育硕士工程硕士建筑学硕士临床医学硕士工商管理硕士农业推广硕士兽医硕士公共管理硕士口腔医学硕士公共卫生硕士军事硕士会计硕士体育硕士艺术硕士风景园林硕士汉语国际教育硕士翻译硕士目录提要…………………1第一章前言………2第二章实验仪器和材料…………10第三章rhGH相关蛋白质的确定与研究………11第四章rhGH冻干制剂缓冲体系的筛选与确定…16第五章rhGH冷冻干燥配方筛选及研究…………33总结……………46参考文献…………47中文摘要…………50英文摘要…………52提要人生长激素(HumanGrowthHormone是由脑垂体前叶含有嗜酸性粒细胞所分泌的、由191个氨基酸残基构成的肽类激素,是人体内促进生长的主要激素。high在水溶液中不稳定,易产生氧化、脱酰氨、聚合等变化。文献报道生长激素的氧化位点主要发生在14位和125位的蛋氨酸残基上。生长激素发生氧化、脱酰氨反应之后,其生物活性也会随之下降,氧化和脱氨组分的存在被认为是质量下降的重要表现。另外,剧烈震荡、高温等条件下生长激素易形成二聚体和多聚体,从而降低或丧失生物学活性。因此,防止氧化、脱酰氨、聚合是生长激素制剂研究中的重点,在贮存和运输的过程中保证生长激素的质量和稳定性是非常必要的。冷冻干燥技术是保护重组蛋白质活性最为常见也是最为重要的一种方法,一个好的冻干配方制成的冻干制剂能够长期保持蛋白质或多肽的活性。为此,本论文通过选择缓冲液,摸索其浓度、pH,加入一定量的保护剂、赋形剂和表面活性剂,并对每种添加组分及相关参数进行了一系列摸索、筛选、检测实验,最终确定rhGH冻干制剂配方组成及参数。通过冷冻干燥技术,最大限度维持了重组人生长激素在贮存过程中的稳定性,延长了药品的有效期。第一章前言19世纪,人们在人的脑垂体前叶提取并分离出一种对生长有作用且具有活性的成份,命名为生长激素[1](GrowthHormone,GH。研究证明,生长激素对骨骼,内脏和全身的生长都有重要作用,而且对蛋白质合成、脂肪、糖类的代谢速率都有影响,故生长激素在人体生长发育中是不可或缺的。1.1人生长激素与重组人生长激素(RecombinantHumanGrowthHormone,rhGH人生长激素是由191个氨基酸残基构成的单一肽链的激素,分子量为22KD左右,有2个二硫键[2],pI=5.2,分子中无糖基化。high的基本功能是刺激机体组织的发育,促进人体的骨骼,软骨和组织的生长,生长激素对中间代谢及能量代谢也有影响。具体可促进蛋白质合成,增强对钠、钾、钙、磷、硫等重要元素的摄取与利用,同时通过抑制糖的消耗,加速脂肪分解,使能量来源由糖代谢转向脂肪代谢。人在幼年时,如果生长激素分泌不足,会导致生长发育迟缓,身体长得特别矮小,称“侏儒症”;如果生长激素分泌过多,可引起全身各部过度生长,骨骼生长尤为显著,致使身材异常高大,称“巨人症”。成年后,骨骺已融合,长骨不再生长,此时如生长激素分泌过多,将刺激肢端骨、面骨、软组织等增生,表现为手、足、鼻、下颌、耳、舌以及肝、肾等内脏显示出不相称的增大,称“肢端肥大症”。对侏儒症应尽早给予生长激素治疗,巨人症和肢端肥大症如果是垂体前叶肿瘤所致,可进行局部放射线照射治疗或手术切除,大剂量雌激素有抑制垂体分泌生长激素的作用。早在二十世纪八十年代,由于生长激素来源稀少,导致其未能得到广泛应用[3]。近年来科学家已用基因工程方法将人类生长激素基因从染色体DNA链上分离出来,重组到质粒上,并用大肠杆菌进行表达,依靠大肠杆菌发酵生产重组人生长激素。rhGH的氨基酸含量、空间构象及序列与人生长激素完全相同,具有与人体内源性生长激素等同的生物学作用:刺激骨骺端软骨细胞分化、增殖,刺激软骨基质细胞增长,刺激成骨细胞分化、增殖,引起线性生长加速及骨骼变宽;促进全身蛋白质合成,纠正手术等创伤后的负氮平衡状态,纠正重度感染及肝硬化等所致低蛋白血症;刺激免疫球蛋白合成,刺激淋巴样组织、巨噬细胞和淋巴细胞的增殖,增强抗感染能力;刺激烧伤创面及手术切口胶原体细胞合成纤维细胞以及巨噬细胞分裂增殖,加速伤口愈合;促进心肌蛋白质合成,增加心肌收缩力,降低心肌耗氧量,调节脂肪代谢,降低血清胆固醇、低密度脂蛋白的水平;补充生长激素分泌不足或缺乏,调节成人的脂肪代谢、骨代谢、心肾功能。生长激素的临床应用已有近半个世纪,大量的动物实验及临床研究表明生长激素疗效确切,副作用极少[4-6]。1.2重组人生长激素的发展史19世纪,研究人员发现了对生长有重要作用的物质,这种物质是由人的脑垂体前叶嗜酸性细胞分泌的蛋白激素,并命名为生长激素(GroH现。1957年,Raben首次从人脑垂体中分离出人生长激素(high随后开始用于儿童侏儒症的治疗,但是由于人的垂体来源有限,产量稀少,在使用过程中因为用量不够,而不能满足增高的需求,另外由于其易受high供体病毒感染,于1985年被FDA禁止使用[7]。1979年,随着生物技术的快速发展,基因工程技术的成功应用使得high在大肠杆菌中的表达成为可能,最初合成的大肠杆菌源性的重组人生长激素(rhGH与天然high相比,在N-末端多了一个蛋氨酸残基,为192肽。其提取工艺复杂,容易产生抗体,生物活性偏低,在人体内容易引起免疫反应而影响增高效果[8]。20世纪80年代中期,美国Genentech公司研制出了N端去除蛋氨酸的191肽重组人生长激素,其结构和生物功能与人生长激素(high完全相同,从此,生长激素的应用在全球得以扩大[9]。20世纪80年代末期,在哺乳动物细胞模型中成功的合成了含有191个氨基酸的人生长激素,优点在于应用该方法合成的生长激素与天然的生长激素结构最为接近,但存在无法克服的缺点:①细胞培养无菌及环境要求较高、培养周期长、收率较低;②动物源性感染;③会导致肿瘤的生长。目前仅有极少数厂家生产[10]。20世纪90年代,金磊大肠杆菌分泌表达技术[11]合成的重组人生长激素具有氨基酸含量、序列和蛋白质结构与人垂体分泌的生长激素完全一致,生物活性、效价、纯度和吸收率极高,在降低生产及治疗成本的同时确保产品的安全性、有效性和稳定性的优点。该技术被国际大多数领先企业采用,其生产的产品已占据全球95%以上的市场。经过多年研究后,国内的基因重组人生长激素的生产技术也取得了突破性进展,1998年,归国博士金磊创办了长春金赛药业股份,应用分泌型表达技术成功的在中国上市了第一支重组人生长激素——注射用重组人生长激素金磊®赛增®,填补了国内空白,结束了长期依赖进口国外产品的历史。经过10余年的临床应用证明,长春金赛药业股份采用的大肠杆菌分泌型表达是一种最成熟和最稳定的重组人生长激素生产技术,采用该技术生产的产品活性高,副作用小,是一种安全、有效的生长激素。此公司于2005年又上市了亚洲第一支重组人生长激素注射液(水剂,水剂保持了生长激素的原始状态,具有生物活性高、产生的抗体少、见效速度快、副作用相对较少,如长期治疗其效果明显等优点[12]。1.3生长激素(GH的功能及在临床方面的应用在生长激素被发现的初期,由于来源有限,产量稀少,只能用于因生长激素缺乏或不足而导致的儿童矮小症。随着生物技术的发展,基因重组人生长激素的问世,临床用量得到了保证。随着对生长激素研究的深入,人们发现生长激素可治疗成人生长激素缺乏(GHD、组织修复、艾滋病消瘦、烧烫伤、Turner氏综合症等症状。近年来,随着科学技术不断的发展,对生长激素的临床研究也不断深入,发现生长激素在抗衰老、骨质疏松症、心脑血管疾病治疗方面也有很好的效果[13-15]。1.4研制重组人生长激素冻干制剂的背景和意义1.4.1影响重组人生长激素不稳定性的外界因素重组人生长激素(rhGH受物理或化学因素的影响很大,在外界条件发生变化时,重组人生长激素的性质常有所改变,因此会表现出不稳定的性质。人们把多肽和蛋白质的不稳定性分为两种:即物理不稳定性和化学不稳定性[16]。(1物理不稳定性的影响在物理不稳定性中,最常见的类型是聚合反应。生长激素的结构非常复杂,而温度和pH值就是影响其稳定性的主要因素。外界温度越高,稳定性就会越差。当蛋白质暴露在生理环境或与有机溶剂接触时易发生蛋白聚合,形成非正确折叠导致的蛋白聚合体[17]。一些物理因素如增加压力、剧烈搅拌、温度急降和射线等也都会使rhGH的聚合物加速形成。由于重组人生长激素结构的复杂性,温度对重组人生长激素的结构和生理功能的影响很难总结。在一般情况下,提高温度,重组人生长激素结构越容易发生变化,其稳定性也越差[18-20]。蛋白质和多肽类生物制品一旦处于极端pH值时,其分子间的静电排斥力将增加,会降低静电自由能并导致蛋白质的错误折叠甚至变性。此外,盐桥也是维持蛋白质构象不可或缺的因素,虽然其数目很少,但贡献很大,而极端的pH值会减少盐桥的形成,导致蛋白质稳定性的降低,使更其趋向于聚合[21]。(2化学不稳定性的影响化学不稳定性涉及共价键的合成和断裂的过程,生成新的化学实体,常见类型如下:1脱酰胺反应。重组人生长激素的脱酰胺作用主要发生在149位和152位的天冬酰胺残基上。脱酰胺反应的动力学主要受外在因素影响,例如pH、温度和离子强度等,添加剂对脱酰胺反应速度的影响也很大。非酶催化的脱酰胺反应与环境条件和多肽的结构有关,提高或降低pH值、升高或降低温度都将影响脱酰胺反应的进行。2氧化反应。重组人生长激素被氧化的主要原因是由于溶液中会溶解了氧,其分子中处与14位和125位的甲硫氨酸易发生氧化反应。蛋白质和肽氧化作用通常分为两大类:即特定的氧化反应和非特定氧化反应,其氧化率受内在和外在两个因素影响。内在因素包括肽链的活性和蛋白质整体结构的影响。外在因素诸如pH值和缓冲液等条件,也直接会影响蛋白质的氧化率。虽然目前认为rhGH的脱酰胺和氧化形式没有生物毒性,生物活性或受体结合特性的改变也很少,但是与天然的rhGH相比较,但是脱酰胺和氧化后的rhGH的稳定性却降低了很多。3水解反应。多肽中的肽键易水解断裂,在重组人生长激素中,由Asp参与形成的肽键比其它肽键更易断裂。4二硫键的错配。游离半胱氨酸残基的去除可以大大缓解二硫化物干扰和交换。尽管二硫键的数目在重排前后是相同的,但由于其化学键已经被打断和再连接,会直接导致三级结构改变和活性丧失[22]。1.5提高重组人生长激素稳定性的途径1.5.1聚乙二醇(PEG修饰聚乙二醇(PEG修饰是当前生长激素相关研究中的热点。PEG是一种亲水性强的高分子化合物,在体内可降解,无毒。PEG与多肽或蛋白结合后,一方面可提高其溶解度,另一方面由于分子量的增大,能够有利于肾小球的重吸收,从而延长药物的体内半衰期,达到长效的目的。PEG对多肽或蛋白药物的修饰,不会影响到其主要生物学功能——包括与受体结合等等[23,24]。对修饰产物的检测,通常采用高效液相色谱法,其中以体积排阻色谱法(HP-SEC较为常用法可。1.5.2使用辅料和添加剂在蛋白质药物中加入不同的赋形剂,可使蛋白质类药物稳定性和有效期得以延长。辅料主要包括糖类、盐、表面活性剂和大分子化合物等。低浓度糖类能够使更多的水分子围绕在蛋白质周围,提高重组人生长激素的稳定性;表面活性剂可抑制蛋白质的聚集、沉淀和吸附等物理不稳定性;盐类可以起到稳定蛋白质的作用;大分子化合物稳定蛋白质的作用机制主要包括提高空间隐蔽度、限制蛋白质运动及优先吸附等[25]。1.5.3真空冷冻干燥技术自1935年第一台商用冻干机问世以来,冷冻干燥技术逐步在血液制品、医药、食品、超微细材料等领域得到了较为广泛的应用[26]。真空冷冻干燥的主要步骤如下:1,将含有大量水分的药品溶液在低温下预先冻结;2,在真空条件下使水蒸汽直接升华干燥,除去冰晶;3,待升华结束后,进行解吸干燥,除去部分结合水。该过程包括:药品准备、预冻、一次干燥(升华干燥和二次干燥(解吸干燥、密封保存五个步骤[27]。在蛋白质溶液中加入保护剂,再使用冷冻干燥的方法,使得蛋白质能够长期稳定的保存。1.6蛋白质冻干制品保护剂冻干过程中存在着各种各样的应力,通常包括低温应力、冻结应力、干燥应力等,这些应力常常直接或间接导致蛋白质药物稳定性的下降[28]。因此,常用保护剂来应对各种应力,保护剂包括多羟基化合物、糖类、氨基酸、蛋白质、表面活性剂等。1.6.1多羟基化合物常见的多羟基冻干保护剂有甘油、甘露醇、聚乙二醇等。甘油的作用是促进过氧化氢酶复性,甘油浓度上升至0.8%时,过氧化氢酶能够完全复性。甘露醇可获得优良的骨架,而且其引湿性很小,但是有一定的缺点,例如制备的成品外观粒度较粗、性脆,因此常用糖类与之共同使用,小于1%浓度的甘露醇的加入可阻止蛋白质的聚合,但高浓度的甘露醇则会促进蛋白质的聚合[29]。1.6.2糖类糖类是最常见、使用最广的冻干保护剂,作为是蛋白质的稳定剂,对蛋白质在冻干过程中能起到一定的保护作用。常使用的糖类包括蔗糖,乳糖和海藻糖等,由于乳糖制备后的成品外观洁白,均匀,细腻等,虽然其引湿性能差,但是与甘露醇共同使用,可以取长补短,获得外观美观,引湿性较小的冻干样品。而蔗糖是一种化学性质稳定的双糖,具有无定型的结构,在冻干过程中可阻止蛋白质聚合物的生成。海藻糖广泛存在于自然界中,是一种性质稳定的双糖,具有无还原性、高玻璃化温度等优点,能在高寒、高温、高渗透压和干燥失水等极其恶劣条件下有效地保生物大分子结构不被破坏,维持生命体的生命过程和生物特征。外源性的海藻糖同样对生物大分子和生命体具有良好的非特异性保护作用,所以海藻糖的这些优点可在冻干过程中具有更广阔的应用前景[30]。尽管在冻干过程中,糖对多数蛋白质都能够起到保护作用,但并不是所有的蛋白质都可以被糖保护,这仍需要进一步的研究。1.6.3氨基酸某些氨基酸也是蛋白质有效的保护剂。如低浓度的甘氨酸可通过调节pH值而阻止蛋白质药物在冻干过程中的变性[31],1.6.4蛋白质蛋白质类保护剂可分为两种:一种是蛋白质药物本身,另一种为外来的蛋白质。一些蛋白质经冻融后的活性直接和蛋白质的起始浓度有关,起始浓度升高有时会促进蛋白质的复性[32]。一种常用的外来蛋白质类保护剂为血清白蛋白,它是一个经典、优良的蛋白质稳定剂,但由于其是血液制品,容易给药品带来污染。1.6.5其他在冻干制品中加入一定量的吐温-20、吐温-80、SDS等表面活性剂[33]会对冷干过程中的蛋白质起到一定的保护作用。近几年来,某些冻干制品中,加入poloxamer188、盐和胺也可获得一定的蛋白质稳定效果。1.7保护剂的种类及作用(1有些活性物质浓度极小,干物质含量极少,在冷冻干燥时已经干燥的物质会被升华的气流带走。为了改善浓度,增加干物质含量,使冻干后的产品能形成较理想的团块。因此需要加入填充物质,使固体物质的浓度在4~25%之间。这些填充物或赋形剂是:蔗糖、海藻糖、乳糖脱脂、蛋白质及水解物、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、山梨醇等。(2有些活性物质特别脆弱,在冷冻干燥时由于物理或化学原因会受到危害,因此加入一些保护剂或防冻剂,以减少冷冻干燥中的损害。例如,加入二甲亚砜、甘油、右旋糖苷(葡聚糖、糖类、聚乙烯吡咯烷酮等。(3加入某些物质例如甘露醇、甘氨酸、右旋糖苷、木糖醇、聚乙烯吡咯烷酮等,可以提高产品的崩解温度,以得到良好的产品并容易冻干。(4碳酸氢钠、氢氧化钠等可以改变冻干液体制剂的酸碱度,从而改变共熔点以利于冻干。(5抗氧化剂类如维生素C、维生素E、氨基酸、硫代硫酸钠、硫尿等可改变产品贮藏的稳定性、提高贮藏温度,延长贮藏时间。保护剂的范围相当宽广,品种繁多,但不存在一种通用的能够对大多数蛋白其作用的理想保护剂,对于不同的冻干制品也没有一个保护剂的通用配方。每种产品的适宜保护剂需通过反复的试验才能确定。1.8.1真空冷冻干燥技术具有的优点(1在低压下干燥,可使水溶液中的蛋白质类大分子保持原有的生理活性,不易氧化变质;(2冻干时被蛋白可形成独特的多孔"骨架"结构,具有复水性好等特点;(3由于脱水彻底,药物的含水量低,适合长期保存。(4药物的重量、体积在冻干过程中减少,适合运输。1.8.2真空冷冻干燥技术具有的缺点(1冻干设备投资大;(2冻干周期时间长,冻干速率低。1.9研制重组人生长激素(rhGH冻干制剂的意义重组人生长激素(rhGH是一种不稳定的大分子蛋白质,在贮存的过程中很容易发生氧化、脱酰氨、聚合等不可逆的化学反应,从而影响产品的品质和疗效。此外,重组人生长激素(rhGH主要是用来制疗或缓解因生长激素(GH分泌不足或缺乏而导致的儿童矮小症、组织修复、烧汤伤、成人生长激素缺乏(GHD等,且生长激素是处方药,需要临床医生的指导,患者的用药时间长。这些客观条件对生长激素在贮存过程中的稳定性有了更高的要求,目前冷冻干燥是保存不稳定大分子蛋白质的稳定的最好方法,在做冻干剂型时,向其中加入一定量的保护剂、赋形剂、表面活性剂等辅料,不仅可以得到容易贮藏方便的冻干剂型,最重要的是保症了重组人生长激素的稳定性和活性,提高了产品的品质,延长了生物制品的货架期。从而保症了患者的用药安全和药物的疗效。1.8真空冷冻干燥技术的优缺点第二章实验仪器和材料2.1实验仪器高效液相:Agilent1200检测器:VWD工作站:ChemStation色谱柱:SepaxBio-C4:300Å/100um(4.6*250mmWaters:Protein-Pak300SW(7.8*300mm电泳仪:Bio-rad电泳仪(PowerPacBasic电泳槽:Bio-radII型MiniproteanRII紫外分光光度计:Shimadzu紫外可见分光光度计UV-1240型层析柱:GE公司INDEX70*950m柱层析介质:GE公司SephadexG-25层析介质紫外检测器:北京新技术研究所8823A-U检测器记录仪:YOKOGAWA3057pH计:上海雷磁pHS-3C型酸度计电子天平:赛多利斯BP310S水份测定仪:雷磁微量水份分析仪-KLS-4112.2实验材料2.2.1高效液相色谱(HPLC试剂三羟甲基氨基甲烷(Tris;正丙醇(色谱纯;碳酸氢氨;浓盐酸;2.2.2配方试剂组氨酸;柠檬酸;柠檬酸三钠;甘氨酸;磷酸氢二钠;磷酸二氢钠;氢氧化钠;甲硫氨酸;Tween-20;Tween-80;Poloxamer188;甘露醇;蔗糖;海藻糖;第三章rhGH相关蛋白的确定与研究重组人生长激素(rhGH在贮存中会发生脱酰胺、氧化、聚合等,这就会导致脱酰胺产物,氧化产物、聚合体等杂质的生成。用反相高效液相色谱的方法(RP-HPLC检测可以测得脱酰胺产物和氧化产物的吸收峰,用体积排阻高效液相色谱的方法检测可以得到聚合体的吸收峰。两种检测方法中的杂质峰与主峰之间都有很好的分离度,这样,可以通过模拟贮存条件,作氧化脱胺的加速实验,就可以得到含有杂质的rhGH样品。通过不同的高效液相色谱检测方法,就可以检测出杂质峰在色谱图上的保留时间,与没有经过处理的rhGH纯品进行对比,从而确定氧化产物、脱酰胺产物、聚合体的位置。此外,相关资料表明,用体积排阻高效液相色谱的方法检测出的rhGH单体峰面积与其生物活性有相关性。因此,可以用已知生物活性的rhGH为对照品,按照一定的实验方法就能评估出未知生物活性的rhGH,不但测定出rhGH氧化脱胺产物的多少,同时对未知rhGH的活性有了一定的了解。在实验过程中发现:rhGH在液体中聚合的速率低,而化学降解的速率相比较而言却很高,在同样的贮存条件下,脱胺反应相对较快。因此,通过加速实验的方法将rhGH进行氧化脱胺破坏,用RP-HPLC进行氧化和脱酰胺产物的测定,这样就可以通过RP-HPLC的方法测定这两种生成物的量以确定不同因素对氧化和脱酰胺反应的影响。通过与对照品相比,我们确定了氧化脱胺产物在色谱图中的位置。根据以上的实验经验和查阅相关的资料,为了快速获得氧化产物和脱胺产物,确定了如下的实验方法:由于温度对脱酰胺反应的发生影响较大,所以将一定浓度的rhGH原液放在温度较高的条件下贮存一段时间,这样可以加速其脱酰胺反应。rhGH能发生氧化反应是因为蛋白分子中的甲硫氨酸与空气中的氧发生反应,所以氧化产物的获得是通过向rhGH原液中加入双氧水(H2O2,加速了rhGH分子氧化反应的进行。3.1.1氧化反应加速实验用移液枪取浓度为6.0mg/ml的rhGH原液0.5ml,用水6倍稀释,再加入H2O2,终H2O2浓度达到0.1%,摇匀,用0.22µm的针头式滤膜过滤后,平均分装至3个西林瓶中,室温条件下反应4小时后,-20℃冰箱中冻存。3.1.2脱酰胺反应的加速实验用移液枪取浓度为6.0mg/ml的rhGH原液1.0ml,用水6倍稀释,摇匀,用0.22µm的针头式滤膜过滤后,平均分装至6个EP管中,封口膜封口,将其中的3管50℃恒温水浴反应4小时后,取出,-20℃冻存。剩余的3管放在4℃冰箱中做为对照品。3.2样品的检测方法3.2.1HPLC检测方法1GH-RPHPLC液相型号:Agilent1200检测器:VWD色谱柱:SepaxBio-C4(孔径:300Å粒径:5μ4.6mm*250mm流动相:20mMTris-HCl(pH7.0:正丙醇(70:30流速:0.5ml/min检测波长:220nm进样量:20µl洗脱方式:等度3.2.2实验操作将氧化反应加速实验样品、脱酰胺反应加速实验样品及对照品分别进样20µl进行检测,高效液相检测结果及对比图如图3-1,图3-2,图3-3和图3-4:3.1实验方法图3-1对照品GH-RPHPLC检测图谱图3-2脱胺产物的GH-RPHPLC检测图谱图3-3氧化产物的GH-RPHPLC检测图谱图3-4氧化产物、脱酰胺产物、对照品对比图3.3结果与讨论(1从图3-1对照品GH-RPHPLC检测图谱可以看到:色谱图中有一种含量高的物质,可以断定其为rhGH主峰,保留时间为29.593min(2在图3-2脱胺产物的GH-RPHPLC检测图谱中,与对照品图谱对比发现,保留时间为29.690min的峰是rhGH主峰;保留时间为27.255min的峰与对照品图谱中保留时间为27.182的峰相对应,但前者峰高明显高于后者,因为在温度较高的条件下,rhGH发生的反应主要是脱酰胺反应,从图中可以看到,脱胺产物的GH-RPHPLC检测图谱中27.255min处的峰明显增高,因此可以断定,此峰为脱胺产物峰。(3在图3-3氧化产物的GH-RPHPLC检测图谱中发现有两处较高的峰,保留时间分别为25.418min和29.498min,两处较矮的峰保留时间分别为14.094min和15.974min。与图3-1对照品GH-RPHPLC检测图谱对比可知保留时间为29.498min的峰为rhGH主峰,25.418min的峰为氧化产物峰,其余两个保留时间为14.094min和15.974min的峰由于含量较低,在正常贮存条件下很难产生。通过对以上结果分析及图3-4图谱的对比,使用GH-RPHPLC的方法检测,三种物质在图谱中的位置先后顺序为氧化产物、脱酰胺产物和rhGH。氧化产物、脱酰胺产物是由于rhGH的不稳定而产生的相关蛋白质,所以本论文中将二者统称为相关蛋白,聚合产物能用体积排阻的方法(GH-SECHPLC检测,所以称为高分子蛋白。第四章rhGH冻干制剂缓冲体系的筛选及确定蛋白质类药物在存贮的过程中对其稳定性的影响因素主要有外界因素和内在因素两类。近年来,随着基因工程药物的发展,蛋白质类药物在市场上份额有了很大的增长。当前,利用冷冻干燥技术,将蛋白质药物做成冻干制剂仍然是大多数蛋白质药物常用的贮存方法。与液体剂型相比,冷冻干燥不仅可以保持蛋白质类药物的稳定性,而且能够使蛋白质类药物在一定的条件下保存更长的时间,在保证药品品质的情况下延长了药品的货架期。由于rhGH的理化性质,它在水溶液中很不稳定,杂质的产生使药物的生物活性有了很大的损失。冻干制剂在患者使用之前需要先溶解为液态,这就需要在冻干配方中有一种能够保证药物在溶解后的稳定的缓冲体系,为了保证冻干前蛋白生物活性的稳定,以及蛋白类药物冻干复水后,得以保持蛋白的生物活性,因此需要研制出稳定的液体制剂。配方中主要包括:缓冲液、缓冲液的最佳pH值及其最佳浓度、抑制蛋白聚合的非离子表面活性剂。由于蛋白类药物在水溶液中不稳定,对pH值较为敏感,因此,选择合适的缓冲体系及缓冲范围是非常必要的。另外,蛋白药物溶解在缓冲溶液中,氧化和脱酰胺反应的速率由于盐的种类、pH值等是不同的,因此,选择能够抑制氧化和脱酰胺反应的缓冲液尤为关键。4.1rhGH原液的处理方法及操作4.1.1rhGH原液的G-25脱盐用水平衡已预先填充好的G-25(粗颗粒层析柱两个以上柱床体积,柱床体积为2.5L。取浓度为6.0mg/ml的rhGH溶液400ml为上柱样品溶液,上样量不超过柱床体积的20%。蠕动泵流速:60ml/h紫外检测器:波长为280nm,灵敏度为0.5A记录仪:量程为200mV,纸速为2cm/h当紫外吸收示数上升至20mV时,表明rhGH已经达到了一定的浓度,开始收集样品,紫外吸收示数下降至50mV时,停止收集。共收集rhGH水溶液420ml,摇匀,取样,-20℃保存。图4-1G25脱盐紫外检测记录图4.1.2rhGH水溶液含量测定方法2:GH-SECHPLC液相型号:Agilent1200检测器:VWD色谱柱:WatersProteinPAK300(7.8mm*300mm流动相:20mMPB+0.1%TEA(pH7.0流速:0.5ml/min检测波长:214nm进样量:20µl洗脱方式:等度用移液枪吸取rhGH水溶液100µl,用流动相5倍稀释,装入液相进样瓶中;吸取浓度为1.0mg/ml的rhGH对照品100µl,装入液相进样瓶中;对照品,样品分别进样3次,进样量为20µl,检测完毕,积分,用外标法定量。检测结果及图谱如下:表4-1:rhGH含量检测结果项目平均值对照品(峰面积样品(峰面积计算结果:rhGH含量(mg/ml=样品峰面积平均值/对照品峰面积平均值×对照品浓度×稀释倍数=32832.4/32081.5×1.0mg/ml×5=5.12mg/ml图4-2对照品GH-SECHPLC检测图谱图4-3样品GH-SECHPLC检测图谱4.2缓冲溶液的筛选在一定的条件下,rhGH溶液在pH5.5-7.0之间较稳定。所以缓冲溶液的选择应该按照以下原则进行筛选:一是pH值范围在5.5-7.0之间,二是在此范围内应具备强的缓冲能力。通过查阅资料及平时常用的缓冲液性质和安全性、能达到的缓冲范围,初步确定在以下缓冲溶液中进行筛选:磷酸氢二钠-磷酸二氢钠(PB、柠檬酸-柠檬酸三钠(Cit-CitNa3、组氨酸(His、马来酸、Tris-HCl。综合考虑以上几种缓冲液的缓冲范围及文献资料中所提到的rhGH溶液稳定的pH值范围,首先确定几种缓冲溶液在pH6.5的条件下分别进行比较实验,并以rhGH在溶液状态下比较容易发生的氧化脱胺化学反应所产生的相关蛋白及主成分rhGH的纯度为主要考察对象,用高效液相方法(GH-RPHPLC监测rhGH的稳定性变化,通过对检测结果的比较来筛选缓冲体系,最终确定能够维持rhGH稳定性最好的缓冲体系作为rhGH冻干粉针的缓冲成份。因为缓冲溶液只有在一定浓度范围内才具有缓冲能力,浓度过低,达不到预期的缓冲效果;浓度过高,对被保护的蛋白稳定性有负面影响,同时对冻干制剂也会有较大的影响,所以缓冲液的选择浓度过高过低都会影响其应有的作用。在本实验中,参考了文献资料(10,11,被考察的所有缓冲溶液的浓度确定为10mM。4.2.1缓冲溶液筛选样品的制备分别配制待筛选的缓冲溶液200ml,摩尔浓度0.1M,pH均调至6.0;向rhGH水溶液(5.12mg/ml中分别加入配制好的缓冲液母液,使得最后缓冲体系浓度均为10mM,rhGH浓度为1.0mg/ml。不同缓冲体系的样品均配制40ml,0.22um针头式滤器除菌过滤后,分装至干热灭菌过的西林瓶中,每瓶装量为1ml,轧盖。将不同缓冲体系的样品各取10瓶放入37±2℃恒温箱,剩余的放入-20℃冰箱中冷存。4.2.2HPLC检测4.2.2.1GH-RPHPLC的检测37±2℃保存的不同缓冲体系样品各取出2瓶,混匀,上样。-20℃保存的样品稀释至浓度为1.0mg/ml的rhGH作为对照品,检测结果如表4-2。表4-2不同缓冲体系样品GH-RPHPLC检测结果第10天第20天缓冲体系相关蛋白(%rhGH(%相关蛋白(%rhGH(%His8.4190.5915.2284.78Cit-CitNa311.5688.4420.5579.45PB6.5593.4511.6388.37马来酸9.9790.0319.4580.55Tris-HCl11.1888.8219.9780.03结论与分析:通过对表4-2中的GH-RPHPLC检测结果进行比较分析可以得出以下结论,5种缓冲体系中,对rhGH的保护作用由强到弱的缓冲液排列顺序为:PB>His>马来酸>Tris-HCl>柠檬酸三钠。结果表明,在PB缓冲溶液中,氧化和脱酰胺产物含量相对很少,因此PB缓冲体系对rhGH的氧化和脱酰胺的反应有一定的抑制作用。同时,也进一步证明,rhGH在高温条件下容易发生的反应是脱酰胺反应。图4-4rhGH10mMPB缓冲体系37℃10天GH-RPHPLC检测图谱图4-5rhGH10mMPB缓冲体系37℃20天GH-RPHPLC检测图谱图4-6对照品GH-RPHPLC测定结果4.2.2.2GH-SECHPLC的检测检测的样品与GH-RPHPLC检测的样品相同,结果见表4-3:表4-3不同缓冲体系样品GH-SECHPLC检测结果第10天第20天缓冲体系聚合体(%rhGH单体(%聚合体(%rhGH单体(%His0.9499.061.3898.62柠檬酸三钠1.0298.981.4298.58PB0.9799.031.3198.69马来酸1.0099.001.3398.67Tris-HCl1.0598.951.4398.57结论与分析:表4-3中的GH-SECHPLC检测结果表明,37℃±2℃条件下,5种缓冲体系的样品中,聚合体只产生很小的变化,两个时间点相比,各种缓冲液对聚合体的产生速度大致相同。这表明,缓冲液对rhGH聚合反应进行的影响很小,或者说在一定的pH条件下,rhGH很难发生聚合反应。由此可以推断,在稳定性研究过程中,聚合反应不是影响其稳定性的最主要因素。通过对以上不同缓冲体系的初步筛选实验,根据GH-RPHPLC和GH-SECHPLC的检测结果,进行了综合的分析和评价,确定使用PB缓冲液为rhGH冻干制剂的缓冲液。图4-710mMPB缓冲体系rhGH溶液37℃10天GH-SECHPLC检测图谱图4-810mMPB缓冲体系rhGH溶液37℃20天GH-SECHPLC检测图谱图4-9对照品GH-SECHPLC测定结果4.3缓冲溶液浓度的确定缓冲溶液的浓度大小决定其缓冲能力的强弱。浓度过低将起不到缓冲的作用,浓度过高会对要保护的组份产生不良的影响,造成不必要的浪费。所以在制剂研究中,选择最佳的缓冲溶液浓度是非常重要的。在rhGH冻干制剂配方筛选中,如果缓冲溶液浓度过高,盐浓度加大,不但会造成冻干工艺参数的改变,影响冻干效果,而且高盐条件对蛋白大分子会有损害,容易造成蛋白质空间结构发生改变,引起蛋白聚合、絮凝,变性。根据4.2实验结果,我们选取PB缓冲液作为rhGH的缓冲体系,根据PB作为缓冲液在其它药物中常用的浓度范围及缓冲能力,本实验选取了1mM,5mM,10mM和20mM的4个浓度进行比较分析,并监测样品中相关蛋白的百分含量的变化,作为评价依据,最终确定适合于rhGH的PB缓冲溶液浓度。4.3.1样品制备制备4种样品,样品中PB缓冲液的浓度分别为1mM,5mM,10mM和20mM,pH为6.0,每种样品中rhGH的浓度为1.0mg/ml,无菌条件下分装在干热灭菌后的西林瓶中,每种样品40ml,其中样品分别放置在37±2℃和-20℃中保存。分别于10天与20天取样检测,-20℃的样品作为对照品。4.3.2样品的检测分别按高效液相色谱法(HPLC方法1,方法2进和检测,检测结果如表4-4,4-5:表4-4不同摩尔浓度的PB缓冲体系样品GH-RPHPLC检测结果(37±2℃第10天第20天PB缓冲液浓度相关蛋白(%rhGH(%相关蛋白(%rhGH(%1mM12.1287.8819.4380.575mM6.6993.3111.7488.2610mM6.9593.0514.0485.9620mM10.4289.586.0183.99对照品(-20℃2.4197.59结论与分析:由表4-4不同摩尔浓度的PB缓冲体系样品GH-RPHPLC检测结果表明:5mM和10mM的PB缓冲溶液浓度比较适合样品保存。1mM的样品缓冲能力不足,没有保护作用,20mM的样品由于盐离子浓度过高,从检测结果上看也不利于对样品的保护。5mM对rhGH的保护能力略强于10mM,最终确定PB缓冲溶液的浓度为5mM。图4-105mMPB缓冲体系rhGH溶液37℃放置10天GH-RPHPLC检测图谱图4-115mMPB缓冲体系rhGH溶液37℃放置20天GH-RPHPLC检测图谱图4-12对照品GH-RPHPLC检测图谱表4-5不同摩尔浓度的PB缓冲体系样品GH-SECHPLC检测结果(37±2℃第10天第20天PB缓冲液浓度聚合体(%rhGH单体(%聚合体(%rhGH单体(%1mM0.9699.041.4198.595mM0.9899.021.0298.9810mM0.9799.031.3198.6920mM1.0698.941.3898.62对照品(-20℃0.9499.06结论与分析:表中数据显示:不同浓度的PB缓冲溶液对聚合体的产生影响很小,相比较而言,37±2℃条件下存放20天后,聚合产物有很少的增加,rhGH单体的量仍在98%以上。与相关蛋白结果进行分析对比,最后确定冻干制剂的缓冲体系为5mM的PB溶液。图4-135mMPB缓冲体系rhGH溶液37℃放置10天GH-SECHPLC检测图谱图4-145mMPB缓冲体系rhGH溶液37℃放置20天GH-SECHPLC检测图谱图4-15对照品GH-SECHPLC检测图谱4.4rhGH冻干制剂pH值的筛选与确定保存蛋白质的溶液的pH值对大分子蛋白的稳定性有很大的影响,pH值过高或过低都会缩短药物的有效期。溶液的pH值最好远离目的蛋白的等电点,否则容易引起蛋白质的聚集而沉淀。rhGH的等电点是5.2,且在pH5.5-7.0之间较稳定,所以本实验中最初的pH值选择为6.0。为了获得更适合于维持rhGH稳定的缓冲体系,实验中对缓冲体系的不同pH值进行了考察。4.4.1实验方案及样品制备根据4.2和4.3得到的结果,本实验在5mMPB缓冲体系下,选取pH5.5,6.0,6.5和7.0作为pH值考察点,考察pH对蛋白药物稳定性的影响。配制上述四种不同pH值的PB母液,摩尔浓度为0.1M。分别制备相对应的样品并放置在37±2℃和-20℃中保存。在10天与20天两个时间点取样检测,-20℃的样品作为对照品。4.4.2样品的检测HPLC检测结果如表4-6、4-7:表4-6不同pH值的PB缓冲体系样品GH-RPHPLC检测结果(37±2℃第10天第20天pH值相关蛋白(%主峰(%相关蛋白(%主峰(%pH5.59.7990.2116.0683.94pH6.06.5493.4610.6289.38pH6.56.2293.7810.1689.84pH7.06.5193.4911.2388.77对照品(-20℃2.7597.25结论与分析:表4-6中数据显示:一定浓度下,同一缓冲溶液不同pH值对rhGH的保护作用有很大的差别。pH为6.0、6.5和7.0的样品在37±2℃放置20天后,rhGH剩余较多,pH6.5对rhGH的保护能力要大于pH6.0和pH7.0的样品。对不同pH值的样品相关蛋白在高pH值,高温的条件下反应比较剧烈,产物也随之增多,尤其是脱酰胺反应是主要反应。图4-16pH6.5rhGH溶液37±2℃放置10天GH-RPHPLC检测图谱图4-17pH6.5rhGH溶液37±2℃放置20天GH-RPHPLC检测图谱图4-18对照品GH-RPHPLC检测图谱表4-7不同pH值的PB缓冲体系样品GH-SECHPLC检测结果(37±2℃第10天第20天pH值聚合体(%rhGH单体(%聚合体(%rhGH单体(%pH5.52.5597.453.2896.72pH6.01.1698.841.3698.64pH6.51.0198.991.2298.78pH7.01.2298.781.4298.58对照品(-20℃1.0099.00结论与分析:从表中数据可以看出,pH5.5的样品聚合物最高,其它pH值的样品聚合物变化相近。说明在pH5.5条件下,接近于rhGH的等电点,部分蛋白分子发生了聚集现象,产生了聚合体。pH6.0和pH7.0的样品,聚合体的产生略高于pH6.5的样品。综合表4-6和表4-7中的检测数据,rhGH在pH值6.0~7.0之间具有较好的稳定性,在pH接近于6.5的条件下,称定性最好。所以最终确定了冻干制剂使用pH值为6.5的PB缓冲体系。图4-19pH6.5rhGH溶液37±2℃放置10天GH-SECHPLC检测图谱图4-20pH6.5rhGH溶液37±2℃放置20天GH-SECHPLC检测图谱图4-21对照品GH-SECHPLC检测图谱第五章rhGH冷冻干燥配方筛选及研究蛋白质药物在冷冻干燥过程中会产生各种各样的应力,复水后稳定性会降低,因此在保证合适的缓冲体系的同时,选择合适的保护剂和赋形剂,优化冷冻干燥方法是非常必要的。5.1rhGH冻干保护剂配方筛选方案根据保护剂的特点及保护剂的文献报道,甘露醇、蔗糖、海藻糖、氨基酸、聚山梨酯-20(Tween-20、聚山梨酯-80(Tween-80、泊咯沙姆188(poloxamer188是冻干配方中必不可少的添加成份,通过适当的配比,对大分子蛋白具有很好的保护效果,可以减少和控制在冷冻和干燥过程中由于低温和失水而损失蛋白质的活性,从而维持蛋白质的稳定性,同时能够保证冻干粉针的良好的外观色泽。此外,大多数的保护剂成份不能同时具有冷冻和干燥条件下的双重保护作用,所以在冻干期间至少要加入两种以上的保护剂以尽量减少冻干过程对蛋白质的破坏。在现有配方中,糖的使用种类主要是蔗糖和海藻糖,这两种糖应用范围最广,但据有关资料报导,海藻糖对蛋白质的保护作用远远要强于蔗糖。本文在冻干配方筛选的过程中,一方面是考察冻干配方中各保护剂的最佳配比,另一方面是在其它成份不变的情况下,海澡糖在对蛋白保护方面所占有的优势,以取代蔗糖。本实验中对以上成份分别进行配比、冻干、检测、评价,通过检测结果逐一筛选出最佳配方。5.1.1配制方法确定配制体积,每种配方保证含有5mMPB,pH为6.5,rhGH浓度为1mg/ml。用电子天平精确称取所需辅料,用水充分溶解,再加入PB缓冲溶液(pH6.5母液,rhGH水溶液(5.12mg/ml,用水稀释至预定配制体积,rhGH终浓度为1.0mg/ml,测pH值,冻干前溶液的pH值应在6.0~7.0之间,用0.22um滤膜除菌,溶液充分混匀后,分装在2ml的西林瓶中,每瓶1.0ml,进行冷冻干燥。5.1.2冷冻干燥方法-45℃条件下预冻10h,缓慢升至10℃,在此条件下真空干燥20h。通过对外观色泽、水分、水溶性、相关蛋白等检测来对配方进行筛选。5.1.3考察项目和标准根据2021版《中国药典》中重组人生长激素冻干粉针的质量标准,确定对应的考察项目及标准。如表5-1:表5-1考察项目及标准项目名称考察标准外观色泽白色,无脱壁或萎缩现象水份水份含量不大于3%水溶性易溶、可溶、难溶含量标示量的90%-110%相关蛋白不大于13%高分子不大于5%pH值复溶后pH值应在6.00~7.00之间5.2冻干保护剂、赋形剂的筛选试验中,考虑单一因素对冻干制剂的影响,每组配方冻干后放置在温度为37±2℃、和2-8℃条件下,37±2℃条件下保存的样品分别在第30天取样进行相关项目的检测,2-8℃条件下保存的样品作为0时对照品。通过检测结果选出最佳的添加成份的含量和种类,进行其它种类保护剂的筛选实验。最后确定rhGH最佳的冻干配方。5.2.1甘露醇浓度的确定5.2.1.1实验操作分别配制含有5mMPB(pH6.5、1.0mg/ml的rhGH、不同浓度的甘露醇样品,每种样品50ml,0.22um滤器过滤后分装在已灭菌的西林瓶中,每瓶装量0.5ml,按照5.1中冷冻干燥方法进行冻干。配方如表5-2:表5-2含有不同甘露醇浓度的冻干配方组份浓度空白配方1配方2配方3PB(pH6.55mM5mM5mM5mMrhGH1.0mg/ml1.0mg/ml1.0mg/ml1.0mg/ml甘露醇——1.0%3.0%5.0%5.2.1.2检测结果及分析用方法1和方法2分别进行相关蛋白和高分子物质的检测,结果见表5-3、表5-4:表5-3加入甘露醇的rhGH冻干样品0时检测结果检测项目空白配方1配方2配方3外观色泽白色绒毛粉末白色,较多的脱壁或萎缩白色,少量脱壁或萎缩白色,少量脱壁或萎缩水分4.11%2.52%2.34%2.31%水溶性可溶易溶易溶易溶pH值6.516.426.406.35rhGH含量0.83mg/ml0.91mg/ml0.92mg/ml0.90mg/ml相关蛋白质5.54%3.84%3.71%3.97%高分子蛋白1.77%1.41%1.38%1.45%表5-4加入甘露醇的rhGH冻干样品37±2℃贮存第30天检测结果检测项目空白配方1配方2配方3外观色泽白色绒毛粉末白色,较多的脱壁或萎缩白色,少量脱壁或萎缩白色,少量脱壁或萎缩水分4.01%2.50%2.38%2.36%水溶性可溶易溶易溶易溶pH值6.566.456.476.37rhGH含量0.77mg/ml0.87mg/ml0.90mg/ml0.89mg/ml相关蛋白质9.24%6.85%6.72%6.88%高分子蛋白1.94%1.68%1.56%1.63%上表数据表明,由于空白中没有甘露醇作支架,冻干后呈白色绒毛状粉末,水分含量高,与rhGH水溶液相比,冻干后普遍存在的问题是只加入甘露醇的配方对蛋白的保护不够,冻干过程对蛋白损伤很大;配方1中甘露醇量不够,冻干后的样品脱壁或萎缩严重;配方2、配方3均有少量的脱壁或萎缩现象,外观相对好一些,水份含量没有明显的差异。从第30天的检测结果看,甘露醇对蛋白的保护作用很小,但对冻干样品的有一定的骨架支撑作用。综合分析对比,依据辅料的添加以能满足要求的最小加入量和低成本为原则,配方2的甘露醇加入量比较合适。因此,确定rhGH冻干配方中甘露醇的浓度为3.0%。5.2.2糖类的选择及浓度的确定根据5.2.1试验结果,向配方中分别加入不同浓度的蔗糖和海藻糖作为保护剂,同时每种配方中都含有5mMPB(pH6.5、rhGH1.0mg/ml、甘露醇3.0%,对糖种类及糖浓度进行筛选,实验中选择了两种糖:蔗糖,海藻糖。蔗糖为还原型糖,海藻糖为非还原糖,化学性质稳定,是近几年来发现的有比较广泛应用前景的保护剂。糖不仅能保护蛋白质的稳定性,而且还具有支架的作用,但糖的加入量控制不好会影响冻干样品的外观和水溶性,根据现有冻干配方的相关文献和实践经验,确定了如下配方,分装后进行冻干,并对样品进行相关项目的检测,评价,确定较好的配方组合。如表5-5,表5-6:表5-5含有不同蔗糖浓度的冻干配方组份浓度配方1配方2配方3PB(pH6.55mM5mM5mMrhGH1.0mg/ml1.0mg/ml1.0mg/ml甘露醇3.0%3.0%3.0%蔗糖1.0%2.0%3.0%表5-6含有不同海藻糖浓度的配方组份浓度配方4配方5配方6PB(pH6.55mM5mM5mMrhGH1.0mg/ml1.0mg/ml1.0mg/ml甘露醇3.0%3.0%3.0%海藻糖1.0%2.0%3.0%检测结果及分析表5-7各配方冻干样品0时值的检测结果检测项目配方1配方2配方3配方4配方5配方6外观色泽白色,少量脱壁或萎缩白色,无脱壁或萎缩白色,无脱壁或萎缩白色,少量脱壁或萎缩白色,无脱壁或萎缩白色,无脱壁或萎缩水分2.91%2.62%3.23%2.45%2.38%3.16%水溶性易溶易溶可溶易溶易溶可溶pH值6.496.476.396.506.346.32rhGH含量0.92mg/ml0.94mg/ml0.94mg/ml0.93mg/ml0.95mg/ml0.94mg/ml相关蛋白质3.68%3.61%3.66%3.62%3.52%3.63%高分子蛋白1.29%1.25%1.26%1.28%1.18%1.24%表5-8各配方37±2℃贮存第30天的检测结果检测项目配方1配方2配方3配方4配方5配方6外观色泽白色,较多脱壁或萎缩白色,无脱壁或萎缩白色,无脱壁或萎缩白色,较多脱壁或萎缩白色,无脱壁或萎缩白色,无脱壁或萎缩水分2.88%2.60%3.22%2.41%2.32%3.13%水溶性易溶易溶可溶易溶易溶可溶pH值6.516.446.326.506.396.33rhGH含量0.90mg/ml0.92mg/ml0.93mg/ml0.91mg/ml0.93mg/ml0.91mg/ml相关蛋白质6.08%5.62%5.81%5.99%5.33%5.65%高分子蛋白1.42%1.30%1.35%1.35%1.23%1.29根据表5-6、表5-7、表5-8进行分析得出如下结论:(1通过对冻干样品的0时值进行检测发现,甘露醇与蔗糖或海藻糖按一定的比例混合与只加甘露醇的样品相比,各项检测结果没有太大差异,但加入糖后,糖对蛋白具有了一定的保护作用;(237±2℃条件下贮存30天,外观方面,配方1与配方4有了很大的变化,脱壁或萎缩样品增多,相关蛋白和高分子有很大的增加,表明糖的加量少对蛋白质的保护作用不够,对冻干制剂的赋形有一定的影响;(3综合考虑分析,配方2和配方5冻干后的样品在贮存过程中对蛋白质有一定的保护作用,同时外观色泽、水溶性变化不大,相比之下,配方5要优于配方2,所以确定配方5为较优配方,即5mMPB,1.0mg/mlrhGH,3%甘露醇,2%海藻糖;5.2.3氨基酸的种类和浓度的筛选在冻干过程中,选择合理的氨基酸种类和加量,对维持蛋白质或多肽类药物稳定性、活性有很大的保护作用,它可以降低冻干制剂中缓冲盐析出结晶的速率和程度,从而保护主成分的稳定性;加入适量的氨基酸,可控制缓冲盐的结晶,更利于减少冻干期间制剂中缓冲体系的pH变化而引起被保护蛋白质的不稳定性。在冻干中常用的氨基酸有L-色氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸、丙氨酸、精氨酸等,现在,市售的rhGH冻干粉针中大多添加的是甘氨酸,如文献记载,无定型的甘氨酸可阻止在冻干过程中rhGH的聚集,结晶甘氨酸能升高冻干制品的塌陷温度,阻止因塌陷而引起的对蛋白质药物的破坏。本试验中主要对甘氨酸和精氨酸进行筛选。根据5.1.2的实验结果设计如下配方,具体加入量如表5-9:表5-9含有甘氨酸或精氨酸的配方组份浓度配方1配方2配方3配方4PB(pH6.55mM5mM5mM5mMrhGH1.0mg/ml1.0mg/ml1.0mg/ml1.0mg/ml甘露醇3.0%3.0%3.0%3.0%海藻糖2.0%2.0%2.0%2.0%甘氨酸1.0%2.0%————精氨酸————1.0%2.0%检测结果及分析按方法1和方法2进行检测,结果如表5-10,5-11:表5-10加入甘氨酸或精氨酸的rhGH配方冻干样品0时检测结果检测项目配方1配方2配方3配方4外观色泽白色,无脱壁或萎缩白色,无脱壁或萎缩白色,无脱壁或萎缩白色,无脱壁或萎缩水分2.48%2.39%2.43%2.45%水溶性易溶易溶易溶易溶pH值6.496.446.416.50rhGH含量0.96mg/ml0.99mg/ml0.95mg/ml0.97mg/ml相关蛋白质3.32%3.18%3.42%3.39%高分子蛋白1.12%1.08%1.11%1.10%表5-11加入甘氨酸、精氨酸的rhGH冻干样品37±2℃贮存第30天检测结果检测项目配方1配方2配方3配方4外观色泽白色,无脱壁或萎缩白色,无脱壁或萎缩白色,无脱壁或萎缩白色,无脱壁或萎缩水份2.48%2.39%2.43%2.45%水溶性易溶易溶易溶易溶pH值6.496.446.416.50rhGH含量0.93mg/ml0.97mg/ml0.94mg/ml0.94mg/ml相关蛋白质5.19%5.02%5.22%5.10%高分子蛋白1.18%1.12%1.19%1.15%由表5-1-10,表5-1-11可以得出如下结论:加入氨基酸后,冻干对蛋白质的破坏进一步减小,0时值结果差别不大;在37±2℃条件下贮存30天后,4种配方中,配方2的相关蛋白和高分子蛋白的变化要小于其它配方,所以确定配方2为较优配方,即配方中含有5mMPB,1.0mg/mlrhGH,3%甘露醇,2%海藻糖,2%甘氨酸。5.2.4表面活性剂的筛选经过对缓冲体系、pH值、甘露醇、糖类、氨基酸的筛选试验后发现,在加速试验中,与最初贮存在-20℃的rhGH水溶液相比,加入各种保护剂的相关蛋白质和高分子蛋白的变化仍然有可优化的空间。据相关的文献资料报道,在冷冻干燥的样品配方中加入聚山梨酯80(Tween-80,聚山梨酯20(Tween-20、十二烷基磺酸钠等表面活性剂能够对蛋白质在冻干过程中起到一定的保护作用[33],近年来,在配方中加入Poloxamer188也可获得特定的蛋白质稳定效果。Poloxamer188是一种有广泛应用前景的表面离子活性剂,无臭无味无刺激性,毒性和溶血作用小,能与大多数药物配伍,化学性质稳定,可高压蒸汽灭菌而不会分解破坏。为了保证冻干的rhGH更加稳定,在5.2.3所得配方的基础上加入表面活性剂。根据现在大多数市售冻干粉针中常用的几种表面活性剂和