检测技术及梅毒实验室检测技术

窗口期HIV感染后的血清学动态Anti-P24HIVRNA感染1周2周3周4周………………1年2年3年………..10年………..急性期潜伏期Anti-gp41/120(anti-gp36)Ag艾滋病期Ab浓度当前1页，总共39页。试验室假阴性报告的原因分析窗口期非典型血清学转换病毒变异实验室误差实验室进行艾滋病抗体筛查很很多的原因可能造成漏检,曾经有文献具体分析过造成漏检的原因,主要原因有因为窗口期的原因造成漏检,因为病毒变异以及实验室误差等原因造成的漏检.其中最主要的原因是因为窗口期的问题造成的漏检.占整体比例的93.7%.

当前2页，总共39页。筛查试验复核检测确证试验检测程序及流程图当前3页，总共39页。

HIV抗体筛查检测流程样品初筛试验筛查试剂阳性反应阴性反应复检试验原有试剂+另一不同原理（或厂家）试剂或另外两种不同原理（或厂家）试剂均阳性反应一阴一阳均阴性反应确证试验报告阴性

当前4页，总共39页。酶联免疫吸附试验（ELISA）化学发光法快速检测及其它检测

明胶颗粒凝集试验（PA）

免疫渗滤试验：斑点ELISA和斑点免疫胶体金（或胶体硒）快速试验电化学发光试验其它快速筛查试验方法艾滋病唾液尿液检测试剂初筛检测方法当前5页，总共39页。酶联免疫试验(ELISA)

最早用于检测血清中HIV抗体的有效筛检方法；很高的敏感性和特异性；

HIV抗体检测试剂根据其抗原的来源和检测方式可分为四代；根据检测方法，可分成四类间接法、双抗原夹心法、竞争法和捕获法。当前6页，总共39页。（1）胶体金（胶体硒）法（2）明胶凝集法（3）斑点印迹试验（4）电化学发光法快速检测方法当前7页，总共39页。（1）胶体金法原理：采用双抗原夹心法免疫测定原理，使用纯化HIV-1/2基因重组抗原，分别固定于硝酸纤维膜上，作为检测线，并且用这些抗原标记胶体金。当待检样本中存在HIV抗体时，先和金标记抗原结合，由于层析作用向前移动，当遇到膜上固定的抗原时，形成Ag-Ab-Ag-AU复合物而富集在包被线上，形成一条或二条红色线，是阳性结果。反之，若标本中不存在HIV抗体，则不会出现红线，是阴性结果。无论样本中是否含有HIV抗体，在质控线区域都会形成另一条红色线。

T-检测线C-质控线当前8页，总共39页。1.准备试剂与相关耗材2.每个样本检测用一片试剂，标上相应样本编号.

3.加入50µl全血或血清和血浆4.5-20分钟读取结果

5.读取和记录检测结果.

当前9页，总共39页。阳性反应：在质控窗和反应窗均显示红线。阴性反应：只在质控窗出现红线，反应窗没有红线。无效：在质控窗没有出现红线，说明检测无效，需要重新检测。当前10页，总共39页。第四代试剂

联合检测HIVP24抗原和抗HIV抗体电化学发光法当前11页，总共39页。第一代艾滋病抗体检测试剂检测的是HIV-1的IgG抗体,检测的窗口期大约是42天.第二代试剂可以检测HIV-1和HIV-2型的IgG抗体窗口期缩短至35天.第三代的试剂可以同时检测IgG和IgM抗体,将检测的窗口期又缩短至22天.第四代的可以联合检测HIV的P24抗原和HIV-1/2型抗体的试剂,大约平均比较第三代试剂缩短6天时间.

当前12页，总共39页。ElecsysHIVCombi的检测原理罗氏第四代HIVCombi试剂检测的是HIVP24抗原和HIV-1/HIV-2抗体.检测P24抗原使用的是单克隆的HIV抗体.检测HIV-1/2抗体使用的是大量的重组抗原,来捕捉IGg和IGM抗体.

钌生物素辣根过氧化物酶标记的磁性珠电化学发光当前13页，总共39页。快速检测法的优先使用

技术角度需要考虑：需要快速得到结果、免去试剂和样本的冷链运输环节、小空间实验室的成本效益、检测的简单性等。

优先使用包括：应急、门诊急诊，如VCT、母婴传播、临床评估、农村血检、术前检测、紧急事件等。当前14页，总共39页。HIV快速检测的局限性一般不用于血液筛查有一定的假阳性反应窗口期问题：有一定的假阴性反应（尤其暴露时间<3个月）HIV抗体快速检测具有快速优势，但是“快速”并不意味着对早期感染者的快速诊断，因为HIV感染后产生抗体应答需要一段时间，存在窗口期（即从暴露至最早检测出的时间），即使采用分子生物学试验，也有1～2周的窗口期。当前15页，总共39页。阴性－－报告“HIV抗体阴性”阳性－－出具“HIV抗体待复查”报告（1）不能出阳性报告。（2）同时尽快进行以下处理：

在广州市疾病预防控制中心数字化信息系统填写送检病例信息，打印送检单，重新采血，两份血和纸质版送检单一并送筛查中心或确证实验室；做检测后咨询；初筛阳性告知。（注意告知技巧）

筛查检测结果的报告和处理当前16页，总共39页。抗体筛查试验的局限性阳性结果需用其他试剂复查以及确证。阴性结果有时不能排除HIV感染:(1)在感染早期，血清阳转前存在“窗口期”，在感染晚期，某些抗体可能检测不到（如p24抗体）。

(2)反应中抗体过量，抗原抗体比例不合适而不能形成特定结构，出现凝集抑制。当前17页，总共39页。艾滋病实验室生物安全生物安全细则职业暴露的防范当前18页，总共39页。梅毒实验室检测技术广州医科大学附属第五医院检验科詹铀超当前19页，总共39页。主要内容实验室检测注意事项及临床意义梅毒实验室检测策略探讨当前20页，总共39页。常用梅毒实验室检测方法病原学检测血清学检测当前21页，总共39页。病原学检查原理：一期、二期梅毒时，取硬下疳、扁平湿疣、黏膜斑等皮损部位组织液或淋巴结穿刺术得到的组织液，在暗视野显微镜下，光线从聚光器的边缘斜射到涂片上的梅毒螺旋体而发出亮光，从而可根据其特殊形态和运动方式进行检测。方法：（1）暗视显微镜检查（2）镀银染色法 （3）核酸检测（血液标本？）注：梅毒螺旋体目前体外人工培养还没有获得成功， 仅能通过接种兔睾丸等部位进行有限增殖。当前22页，总共39页。梅毒血清学检测方法1)非梅毒螺旋体抗原血清学试验 （非特异性梅毒抗体）(2)梅毒螺旋体抗原血清学试验 （特异性梅毒抗体）两类方法。当前23页，总共39页。非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理梅毒螺旋体一旦感染人体，宿主可对螺旋体表面的脂质作出免疫应答，产生抗类脂抗原的抗体（非特异性抗体）。未经治疗的病人，其血清内的非特异性抗体可长期存在。经正规治疗后，非特异性抗体可以逐渐减少滴度至转为阴性。当前24页，总共39页。非梅毒螺旋体抗原血清学原理方法包括：（1）快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)（2）甲苯胺红不加热血清试验（TRUST）（3）性病研究实验室试验(VDRL)等。基本成分是心磷脂卵磷脂和胆固醇抗原抗体结合形成复合物，凝集成网状沉淀颗粒被肉眼所见上述方法的敏感性和特异性都基本相似当前25页，总共39页。非梅毒螺旋体抗原血清学试验原理示意图当前26页，总共39页。非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点1、仪器：水平旋转仪，转速100r/min，转幅约18mm2、定性试验加样：吸取0.05mL血清(浆)放在卡片圈中，并均匀地涂布在整个圈内加抗原：将抗原轻轻摇匀，用9号针头加1滴抗原（60滴/mL，1滴=17ul）反应：水平旋转仪旋转8分钟(23℃-29℃）亮光下观察结果。当前27页，总共39页。非梅毒螺旋体抗原血清学试验操作要点3、定量试验稀释夜准备：在反应纸板圈内加入50uL生理盐水（根据需要确定圈数),勿将盐水涂开加样：吸取50uL血清（浆）与各圈中盐水作系列稀释，并涂布整个圈内。下同定性实验。1:11:21:8当前28页，总共39页。非梅毒螺旋体抗原血清学试验临床意义早期梅毒（一期、二期）经足量规则抗梅毒治疗后一期梅毒1年后转为阴性二期梅毒2年后转为阴性。晚期梅毒治疗后血清滴度下降缓慢，2年后约50%病人血清反应仍为阳性。非梅毒螺旋体抗原血清试验方法简单、快速、敏感性和特异性较好。适用于大量人群的筛查。因治疗后血清滴度可下降并阴性，故可作为疗效观察、判愈、复发或再感染的指征。当前29页，总共39页。非梅毒螺旋体抗原血清学试验特点假阳性反应技术性假阳性反应一般是由于操作错误引起的假阳性反应，经过重复试验即可排除。生物学假阳性反应(一般滴度小1:8），应采用梅毒螺旋体抗原血清学试验如TPPA等进行排除。当前30页，总共39页。梅毒螺旋体抗原血清学试验原理抗原为梅毒螺旋体特异蛋白（包括螺旋体重组特异抗原），检测梅毒患者血中特异性抗梅毒螺旋体抗原的抗体。感染梅毒螺旋体后，一旦梅毒螺旋体抗体试验呈阳性，则患者终身阳性。当前31页，总共39页。梅毒螺旋体抗原血清学试验方法梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)梅毒螺旋体血球凝集试验(TPHA)梅毒酶联免疫吸附试验（ELISA）化学发光免疫分析法（CLIA）梅毒免疫层析法-梅毒快速检测(RT)荧光螺旋体抗体吸收试验（FTA-ABS）梅毒螺旋体蛋白印迹试验（WB）当前32页，总共39页。TPPATPPA试验用梅毒螺旋体致敏明胶颗粒人血清中的抗梅毒螺旋体抗体结合，产生可见的凝集反应，具有较高的敏感性和特异性。TPPA是目前WHO公认的梅毒抗原血清学试验的“金标准”，常用于新方法、新试剂的参照标准。当前33页，