实验室生物安全讲(一)

实验室是人类认识自然、改造自然，利用自然界中与人类生产生活相关的物理、化学、生物、辐射等各种因素，经特殊实验技术，按照科学的规律进行研究（实验）活动的场所。近半个世纪以来，随着实验技术的不断发展，人们已经认识到科研成果在造福人类的同时，同样存在一定的危险，而实验室正是对人类具有一定潜在高危险的工作场所。实验室安全管理应根据各种实验室的专业特点及接触的有害因子进行分类管理，采取不同的安全防护措施，但其与防火、防盗、防水等工作是一个共性的任务。疾病预防控制机构实验室的安全防护主要有：放射（辐射）安全防护化学物品安全防护生物安全防护动物安全防护1当前1页，总共61页。历史上的实验室感染事件1886年郭霍第一次报告了一例霍乱病的实验室感染事件。1951年美国统计的1342个实验室感染病例，涉及69种不同的微生物。1967德国马尔堡病毒实验室感染事件,37人感染，1/4死亡。1979年4月，前苏联一实验室发生泄露事故，泄露出的炭疽芽胞粉剂和爆炸释放出的大量毒雾，造成附近1000多人发病，数百人死亡。1993年美国CDC报告了17名实验室人员因职业接触感染HIV。SARS冠状病毒引起的实验室感染事件：2003年台湾一研究人员在BSL-4实验室被感染；2003年新加坡一名博士后研究生在实验室被感染；2004年北京一个国家级病毒病研究机构，一名安徽医科大学研究生被感染。2当前2页，总共61页。与致病微生物接触就存在安全问题

1974年丹麦某医院临床生化实验室的工作人员体检时发现肝炎发病率比普通人群高出7倍。1976年英国某医学实验室的工作人员体检时发现结核菌感染者比其他人群高5倍。1978年英国报告一个商业洗衣房因清洗来自一Q热实验室的衣裤时发生6例雇员和1例参观者感染。3当前3页，总共61页。据统计，从事病原微生物研究的工作人员发生实验室感染的概率较普通人群高5~7倍。实验室感染事件将不仅损害实验室工作人员的健康，给所在单位和部门带来不利影响，甚至可造成疾病的流行，危及广大群众的健康和生命安全，乃至妨碍社会经济的发展以及和谐社会的建设，造成严重的后果。为此，防止实验室生物危害，保障公众健康和安全，实验室生物安全必须引起高度重视。4当前4页，总共61页。第一章

实验室生物安全概述5当前5页，总共61页。第一节实验室生物安全的概念6当前6页，总共61页。一、生物危害（biologicalharm）（一）概念

广义的生物危害是指各种生物因子对人、环境和社会造成的危害或潜在危害。狭义的生物危害是指在实验室进行感染性致病因子的科学研究过程中对实验室人员造成的危害和对环境的污染。

7当前7页，总共61页。（二）生物危害的来源

1.来源于人和动物的各种致病性微生物。如：鼠疫；霍乱；SARS;疯牛病；禽流感。

2.来自外来生物的入侵。我国原来没有的外来生物引起人，农作物，牲畜病虫害的致病因子，如美国白蛾。

3.来自转基因生物可能的潜在危险。

1998年研究发现老鼠食用转基因土豆后免疫系统受到破坏，转基因的生物安全评价成为人们日益关注的焦点。

4.来自生物恐怖事件。

2001年9.11后美国炭疽杆菌引起的感染和死亡事件。8当前8页，总共61页。二、生物安全（biosafety）（一）概念1.生物安全：是指防范、处理微生物及其毒素对人体危害的综合措施。2.实验室生物安全（Laboratorybiosafety）：是指以实验室为科研和工作场所时，避免危险生物因子造成实验室人员暴露、向实验室外扩散并导致危害的综合措施。

即当实验室工作人员所处理的实验对象含有致病的微生物及其毒素时，通过实验室的设计建造（二级屏障）、使用个体防护装置（一级屏障）、严格遵从标准化的工作及操作程序等综合措施:

（1）确保实验室工作人员不受实验对象侵染。（2）确保周围环境不受其污染。9当前9页，总共61页。（二）生物安全的相关术语1.有害生物因子（biohazardousagents）：是指那些能够对人、环境和社会造成危害作用的生物因子，如病原微生物、来自高等动植物的毒素和过敏原、来自微生物代谢产物的毒素和过敏原、基因结构生物体等。

2.

危害废弃物（hazardouswaste）：具有潜在生物危险、可燃、易燃、腐蚀、有毒、放射和起破坏作用的对人、环境有害的一切废弃物。10当前10页，总共61页。3.

气溶胶(aerosol)

悬浮于气体介质中的固态或液态微小粒子形成的相对稳定的分散体系（粒径一般为0.001-10μm）。

微生物气溶胶(microbialaerosol)：微粒中含有微生物。

感染性气溶胶(infectiousaerosol)：微粒中含有致病微生物。

飞沫

(droplet)：由于动物打喷嚏、咳嗽和鸣叫等产生的以唾液、粘液和微生物等为主要成分的气溶胶。飞沫核(deopletcore)：当飞沫中的水分蒸发后剩余的粘液蛋白和微生物等。飞沫有90％以上的直径小于5μm，飞沫核的直径一般为1~2μm，均能长期飘浮在空气中，是引起动物疾病传播的重要途径。11当前11页，总共61页。4.缓冲间（bufferroom）设置在清洁区、半污染区和污染区相临两区之间的缓冲密闭室，具有通风系统，其两个门具有互锁功能，且不能同时处于开启状态。

5.生物安全柜（biologicalsafetycabinet,BSC）是生物安全实验室中极为重要的设备，其主要原理是使安全柜内保持负压，气流只能从外部进入安全柜，使柜内的病原微生物不能溢出，从而保护工作人员；同时其循环风和排风经过高效过滤器过滤，又能保护环境。6.个人防护装备（personalprotectiveequipment,PPE）人们在实验室进行科研活动过程中，为防御各种有害因子而穿戴和配备的各种用品的总称。12当前12页，总共61页。

第二节实验室感染的类型和来源13当前13页，总共61页。一、实验室感染的类型

有三种类型：1.气溶胶导致的实验室感染-------由于实验室中的病原微生物可以以气溶胶的形式飘散在空气中，工作人员吸入了这种污染的空气而造成感染。

2.事故性感染------因为实验室人员操作过程中的疏忽，使本来接触不到的病原微生物污染环境，直接或间接感染实验室人员甚至危及周围环境。

3.人为破坏------有意播散生物制剂。14当前14页，总共61页。二、实验室感染的来源（一）标本

1.检测标本：实验室标本；临床标本。

2.菌毒种：一类；二类；三类；四类。（二）仪器设备使用过程中产生的污染

1．离心机：可能造成实验室感染的有气溶胶、飞溅物和离心管泄漏等。

2．组织匀浆器、粉碎器及研磨器：可能造成实验室感染的有气溶胶、漏和容器破碎等。

3．超声波器具：气溶胶。15当前15页，总共61页。4．真空冷冻干燥机及离心浓缩机：气溶胶；直接接触污染。5．培养搅拌器、振荡器和混匀器：气溶胶；飞溅物；溢出物。6．恒温水浴器和恒温震荡水浴器：微生物生成；气溶胶7．厌氧罐：爆裂，散布传染性物质。8．干燥罐：内爆，散布传染性物质。9．冷冻切片机：飞溅物。16当前16页，总共61页。17当前17页，总共61页。（三）操作过程产生的污染1.接种：气溶胶。应使用无弹力的铂丝接种环，细菌接种后接种环火焰灭菌易崩散，酒精灯烧灼时要特别注意。2.混匀：气溶胶。吸管吸吹菌液时不要产生气泡，应沿容器壁排出。3.研磨：气溶胶。最好使用组织研磨器，乳钵易产生气溶胶。4.移液：吸管上端的棉花松紧要适度，吸液时要从管底吸取，吹出时要轻缓，不要全部吹净，以免产生气泡，形成气溶胶。5.开封：溢出。要避免压力和气流的急剧变化。18当前18页，总共61页。6.离心：离心管套底垫要完好，使用匹配的管、套、离心头，加盖。7.注射：做好个人防护，正确使用注射器。8.搬运：室内移动要避免滑落，移出室外要有坚实密闭的外包装。（四）实验动物接种于实验动物体内的病原微生物，可通过呼吸、粪便等途径排出体外。污染室内环境。试验人员防护或操作不当可造成感染。19当前19页，总共61页。20当前20页，总共61页。21当前21页，总共61页。22当前22页，总共61页。

第三节实验室生物安全防护23当前23页，总共61页。实验室生物安全防护：为了避免实验室中有害的或有潜在危害的生物因子对人、环境和社会造成危害和潜在危害而采取防护措施和管理措施。

硬件：实验室设计建造、设备的配置和使用个人防护装备。

软件：标准化的操作规程和严格的管理规程。生物安全防护的目的：当研究各种对人或动物有致病或生命危险的病原微生物或有害生物因子时，将可能产生的危险降到最低，最大限度的保护人类健康和生态环境。24当前24页，总共61页。一、实验室防护-----硬件(一)一级屏障（primarybarrier）是操作者和被操作对象之间的隔离，以防止操作人员被感染为目的，也称一级隔离。如：安全设备---生物安全柜

个体防护装备---防护服；手套；安全眼镜；呼吸防护装置；紧急冲洗装置；鞋套等。(二)二级屏障（secondarybarrier）是生物安全实验室和外部环境的隔离，也称二级隔离。是一级屏障的外围设施。以防止实验室以外的人员被感染为目的。如：实验室的建筑、结构和装修、电气和自控、通风和净化、给水排水和气体供应、消防和灭菌等。25当前25页，总共61页。26当前26页，总共61页。二、规范化实验室管理-----软件生物安全实验室相关制度及标准化的操作规程的建立。

(一)实验室管理规章制度：包括培训制度、准入制度、健康监测报告制度、个人良好行为制度、意外事故报告制度等。

(二)标准操作程序：包括实验废弃物处置标准操作程序、进出实验室标准程序、菌毒种使用标准操作程序、实验室消毒标准操作程序、意外事故处理标准操作程序及各种仪器设备和实验标准操作程序等。27当前27页，总共61页。第四节生物安全法规

28当前28页，总共61页。一、国际组织和国外病原微生物实验室生物安全相关法规和指南1.《实验室生物安全手册》（WHO）

1988年第一版，1993第二版，2004年第三版2.《微生物危险等级的分类》（欧洲经济共同体EEC）指令93/883.《微生物和生物医学实验室生物安全手册》

（美国）

1983年第一版，1993年第三版，1999年第四版；4.《生物危害主要防护：生物安全柜的选择、安装和使用》

（美国）2000年第二版；5.《实验室生物安全指南》（加拿大）

1990年第一版，1996年第二版，2004年第三版29当前29页，总共61页。二、我国病原微生物实验室生物安全相关法规和标准1.《中华人民共和国传染病防治法》（2004年8月28日通过修订版,2004年12月1日起施行）2.《病原微生物实验室生物安全管理条例》国务院424号令（2004年11月5日通过，2004年11月12日实施）3.《医疗废物管理条例》

（2003年6月4日国务院第十次常务会议通过，2003年6月16日公布实行）4.《中国医学微生物菌种保藏管理办法》

（１９８５年３月２３日卫生部）5.GB19489－2004《实验室－生物安全通用要求》2004年10月1日施行。6.WS233-2002《微生物和生物医学实验室－生物安全通用准则》2002年12月03日发布2003年08月01日实施7.GB50346－2004《生物安全实验室建设技术规范》2004年08月03日发布2004年09月01日实施30当前30页，总共61页。卫生部颁布的配套文件1．《人间传染的高致病性病原微生物实验室和实验活动生物安全审批管理办法》卫生部第50号令，2006年7月10日发布施行2.《可感染人类的高致病性病原微生物菌（毒）种或样本运输管理规定》卫生部第45号令，2005年11月24日发布2006年2月1日起施行3.《人间传染的病原微生物名录》卫科教发[2006]15号卫生部

31当前31页，总共61页。国务院生物安全管理条例《条例》共7章，依次为：1、总则；2、病原微生物的分类和管理；3、实验室的设立与管理；4、实验室感染控制；5、监督管理；6、法律责任；7、附则。共72条。

目的：加强实验室生物安全管理，保护实验室工作人员和公众的健康。适用范围：境内的实验室及其从事的实验活动的生物安全。实验活动：指实验室从事与病原微生物菌（毒）种、样本有关的研究、教学、检测、诊断等活动。32当前32页，总共61页。《条例》规定：国家对病原微生物实行分类管理。根据其传染性、感染后对个体或群体的危害程度，将病原微生物分为一～四类，其中一、二类统称为高致病病原微生物。《条例》规定对实验室实施分级管理，按防护水平和国家标准的规定，将实验室分为一至四级。对三级、四级实验室实行强制认可。33当前33页，总共61页。第二章实验室生物安全风险评估34当前34页，总共61页。所有生物实验室进行生物实验研究必须进行生物安全评估。实验室生物安全评估可帮助实验操作者正确选择生物安全水平（设施、设备和操作），评估职业性疾病风险、制定相应的操作规程和管理规程，采用相应安全防护措施，减少危险性事件的发生。35当前35页，总共61页。第一节病原微生物的风险评估36当前36页，总共61页。一、病原微生物的风险等级中国的病原微生物危害程度分类（2006年我国卫生部制定的《人间传染的病原微生物名录》）：第一类病原微生物：能够引起人类或者动物非常严重疾病的微生物，以及我国尚未发现或者已经宣布消灭的微生物。如:鼠疫耶尔森菌、霍乱弧菌；天花病毒、新疆出血热病毒、埃博拉病毒、猴痘病毒等29种病原体。第二类病原微生物:

能够引起人类或者动物严重疾病，比较容易直接或者间接在人与人、动物与人、动物与动物间传播的微生物。如：炭疽杆菌、布氏杆菌、结核分枝杆菌、艾滋病病毒、高致病性禽流感病毒、乙型脑炎病毒、脊髓灰质炎病毒、狂犬病毒、SARS冠状病毒、西尼罗病毒等70种。

第一类、第二类病原微生物统称为高致病性病原微生物。37当前37页，总共61页。第三类病原微生物:

能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物。如:沙眼衣原体、破伤风梭菌致病性大肠杆菌、脑膜炎球菌、伤寒沙门菌、志贺菌、葡萄球菌；钩端螺旋体；白假丝酵母菌；肠道病毒、轮状病毒、肝炎病毒、风疹病毒、流感病毒、疱疹病毒等275种。第四类病原微生物:

在通常情况下不会引起人类或者动物疾病的微生物。如:小鼠白血病病毒；减毒、弱毒菌株，以及不属于以上三类的各种低致病性微生物菌种。38当前38页，总共61页。39当前39页，总共61页。40当前40页，总共61页。第二节实验室活动的风险评估

实验室活动的风险评估是在实验室活动中可能涉及的传染或潜在传染因子等其他因素的基础上，结合产生危险的实验操作而进行的综合评价。41当前41页，总共61页。实验室内的多种情况都可以造成实验室工作人员感染和实验室环境污染。如：对病原体的操作达不到相应的生物安全操作水平，缺乏严格消毒、隔离等保护措施；对操作过程中产生的微小飞溅、气泡、爆破性气溶胶等没有防止逃逸的设备和措施等。

实验操作涉及：

1.含有已知感染性病原体的物质。

2.含有未知感染性病原体的物质。

3.可能含有未知感染性病原体的物质。

4.含有重组DNA分子的物质。

5.动物研究。42当前42页，总共61页。第三节实验室仪器设备相关的危险与风险评估实验仪器设备是微生物学试验是必不可少的技术装备，在使用中亦有不同程度的感染性生物因子污染的风险，若使用不当也将造成生物危害。尤其是实验室常用仪器，由于与感染性生物因子接触机会较大，更应当注意安全使用规范。

43当前43页，总共61页。实验室仪器设备的风险评估应从以下各方面进行：

1.所有仪器设备是否都经过安全使用认证。

2.在对仪器设备进行维护之前，是否进行了清除污染工作。

3.生物安全柜和通风橱是否进行定期检测和保养。

4.高压灭菌器和其他压力容器是否定期检查。

5.离心机的离心吊桶及转子是否定期检查。

6.是否有盛放碎玻璃的安全容器。

7.是否配备并使用供丢弃锐器的容器。

8.是否配备并使用污染废弃物专用容器。44当前44页，总共61页。第四节实验室生物安全的

环境评估

微生物学实验室中存在不同程度的感染性生物因子的风险，良好的实验室环境是保证生物因子污染最小化的必要条件。45当前45页，总共61页。实验室生物安全环境评估因素涉及：

1.实验室建筑

2.储存设施

3.环境卫生和工作人员设施

4.实验室生物安全保障

5.暖气和通风

6.照明实验室建筑总体是否整齐，并且周围没有障碍物实验室建筑是否清洁地板是否有任何结构缺陷，是否防滑活动空间和走廊是否满足人员通行和大型仪器设备的搬运试验台表面是否耐溶剂和腐蚀性化学品的侵蚀是否每个实验室房间都有洗手池实验室建筑在结构和维护中能否避免啮齿类动物和节肢动物进入及滞留所有暴露在外的蒸汽管道和热水管道是否采取了隔热或防护措施来保护人员安全是否配备有断电时使用的独立供电系统是否安排了储存设备、储存架来确保储存物品不会滑动、倒塌或掉落储存设施里是否堆积有易造成人员绊倒、火灾、爆炸和昆虫匿藏的垃圾、闲杂材料和物品冰箱和储存区域是否上锁建筑物是否处于清洁、有序和卫生的状态是否有饮用水是否提供冷热水、肥皂和毛巾是否分别给男女工作人员提供了更衣间实验室的每一位成员是否都配备了存放日常服装的设施是否有实验室人员进行午餐等活动的房间是否有适当的机构来收集和处理普通生活垃圾噪声水平是否在可接受范围内普通照明是否充分试验台上是否有工作照明日光灯色彩是否和谐是否已经进行了定性的危险度评估来明确规定安全保障系统所保护的范围在不用时整个建筑物是否可以安全的锁上门和窗是否是防破碎的装有危害性物品以及贵重仪器设备的房间是否上锁使用这样的房间、仪器和物品是否进行控制并需批准工作温度是否舒适对于直接暴露在阳光下的窗户是否装有避光窗帘是否有足够的通风换气通风系统是否装有高效空气过滤器机械通风系统是否会影响生物安全柜和通风橱内部及周围气流46当前46页，总共61页。47当前47页，总共61页。第三章实验室生物安全水平48当前48页，总共61页。一．实验室生物安全的分级

根据所操作的生物因子的危害程度和采取的防护措施，将实验室生物安全防护水平（biosafetylevel，BSL）分为4级，１级防护水平最低，4级防护水平最高。分别以BSL-1、BSL-2、BSL-3、BSL-4表示实验室的相应生物安全防护水平。以ABSL-1、ABSL-2、ABSL-3、ABSL-4表示动物实验室的相应生物安全防护水平。一级、二级实验室不得从事高致病性病原微生物实验活动。49当前49页，总共61页。

P1,P2,P3,P4级实验室---实验室的物理封闭水平。为美国国立卫生研究院（NIH）的分级标准。

现美国疾病预防控制中心（CDC）和国际社会许多国家则采用BSL名称----生物安全水平。

P1------BSL-1P2------BSL-2P3------BSL-3P4------BSL-450当前50页，总共61页。二、生物安全实验室分级

----与病原微生物危害程度分类相对应一级、二级实验室不得从事高致病性病原微生物实验活动。三、四级实验室从事高致病性病原微生物实验活动，要通过国家认可，颁发相应级别的生物安全实验室证书，证书有效期为5年。51当前51页，总共61页。生物安全实验室的分级实验室分级处理对象危险等级BSL-1对人体和环境危害较低，不会引发健康成人疾病。Ⅰ级四类BSL-2对人体和环境有中等危害或具有潜在危险的致病因子。Ⅱ级三类BSL-3主要通过呼吸途径使人传染上严重的甚至是致命疾病的致病因子。通常有预防治疗措施。Ⅲ级二类BSL-4对人体有高度危险性，通过气溶胶途径传播或传播途径不明的微生物。尚无预防治疗措施。Ⅳ级一类52当前52页，总共61页。（一）基础实验室1.一级生物安全实验室（P1/BSL-1）：一级生物安全水平：能够安全操作，对实验室工作人员和动物无明显致病性的、对环境危害程度微小的、特性清楚的病原微生物的生物安全水平。用途:(1)教学用的微生物学实验室等。

(2)从事具有明确生物学特征的、已知在健康成人中不引起疾病的活的微生物菌（毒）株的研究；安全装备：

(1)一般不需要生物安全柜;(2)工作人员在实验室应穿工作服，

(3)必要时戴手套或眼罩;(4)配备常规的实验及清洁用具;53当前53页，总共61页。一级生物安全实验室54当前54页，总共61页。实验室设施要求：实验室应设洗手池（靠近出口处）。实验室设计易于清洁。实验台面不透水，耐腐蚀、耐热。实验室窗户应设置纱窗。有专门放置生物废弃物容器的台（架）。接触微生物或含有微生物的物品后，脱掉手套后和离开实验室前要洗手。禁止在工作区饮食、处理隐形眼镜、化妆及存储食物。制定尖锐器具的安全操作规程。按照实验室安全规程操作，降低溅出和气溶胶的产生。每天至少消毒一次工作台面，活性物质溅出后要随时消毒。所有培养物、废弃物在运出实验室前须进行灭活（如高压），需运出实验室灭活的物品必须放在专用密闭容器内。55当前55页，总共61页。2.二级生物安全实验室（P2/BSL-2）二级生物安全水平：能够安全操作对实验室工作人员和动物致病性低的、对环境有轻微危害的病原微生物的生物安全水平。用途：临床、诊断、教学，实验室里所有的中等风险因子，存在于人群并与某些严重性人类疾病有关，但具有有效的治疗和预防措施。安全装备：

(1)生物安全柜（II级）;(2)实验外罩、手套等在离开时必须留在实验室中;不能污染非实验区。

(3)在生物安全柜（II级）外操作感染性物质，要使用个体防护（手套，口罩或眼罩）;(4)实验室提供带锁的门,以及相应的实验清洁设备。56当前56页，总共61页。二级生物安全实验室57当前57页，总共61页。实验室设施要求：满足一级实验室(标准微生物操作规程)各款要求外，还应该满足以下要求：（1）消毒设施（高压灭菌锅、化学消毒装置等）（2）洗眼装置（3）可自动关闭的门锁（4）门口