专题基因工程

专题基因工程第一页，共三十七页，2022年，8月28日（一）基因工程的概念基因工程的别名操作环境操作对象操作水平基本过程结果基因拼接技术或DNA重组技术生物体外基因DNA分子水平人类需要的基因产物剪切→拼接→导入→表达原理基因重组第二页，共三十七页，2022年，8月28日限制性内切酶1.特点：特异性，即识别特定核苷酸序列，在特定的切点切割。2.分布：主要在微生物中。3.结果：产生黏性末端（碱基互补配对）或平末端。4.举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。第三页，共三十七页，2022年，8月28日DNA连接酶的种类：根据酶的来源不同，可分为两类：（1）E.coliDNA连接酶：只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间连接起来（2）T4DNA连接酶：既可以连接双链DNA片段互补的黏性末端，又可以双链DNA片段的平末端第四页，共三十七页，2022年，8月28日运载体1.作用：2.条件：3.种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。4.质粒的特点要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。将外源基因送入受体细胞。第五页，共三十七页，2022年，8月28日作为运载体必须具备哪些条件？（二）基因操作的工具1.能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2.具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3.具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等。第六页，共三十七页，2022年，8月28日大肠杆菌的质粒：（二）基因操作的工具最常用的质粒是大肠杆菌的质粒，其中常含有抗药基因，如四环素的标记基因。质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用，但复制只能在宿主细胞内成。第七页，共三十七页，2022年，8月28日质粒的特点1.细胞染色体（或拟核DNA分子）外能自主复制的小型环状DNA分子；2.质粒的存在对宿主细胞无影响；3.质粒的复制只能在宿主细胞内完成。第八页，共三十七页，2022年，8月28日非编码区非编码区编码区编码区上游编码区下游

与RNA聚合酶结合位点启动子终止子

RNA聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。补：原核细胞的基因结构第九页，共三十七页，2022年，8月28日①不能转录为信使RNA，不能编码蛋白质。：能转录相应的信使RNA，能编码蛋白质

编码区非编码区原核细胞的基因结构②有调控遗传信息表达的核苷酸序列，在该序列中，最重要的是位于编码区上游的RNA聚合酶结合位点。第十页，共三十七页，2022年，8月28日编码区非编码区非编码区与RNA聚合酶结合位点内含子

外显子

能够编码蛋白质的序列叫做外显子

不能够编码蛋白质的序列叫做内含子启动子终止子编码区上游

编码区下游内含子：

外显子：

补：真核细胞的基因结构第十一页，共三十七页，2022年，8月28日真核细胞的基因结构编码区非编码区外显子：能编码蛋白质的序列内含子：不能编码蛋白质的序列：有调控作用的核苷酸序列，包括位于编码区上游的RNA

聚合酶结合位点。非编码序列：包括非编码区和内含子第十二页，共三十七页，2022年，8月28日原核细胞真核细胞不同点编码区是_____的编码区是间隔的、_____的相同点都由能够编码蛋白质的______和具有调控作用的______区组成的原核细胞与真核细胞的基因结构比较编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？连续不连续编码区非编码思考:第十三页，共三十七页，2022年，8月28日一、目的基因的获取1、目的基因主要是指:编码蛋白质的结构基因2、获取目的基因的常用方法有哪些?（1）从基因文库中获取（2）人工合成（3）利用PCR技术扩增第十四页，共三十七页，2022年，8月28日

将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库基因文库

基因组文库部分基因文库（如:cDNA文库）1.基因文库(一)从基因文库中获取目的基因第十五页，共三十七页，2022年，8月28日基因组DNA文库限制性内切酶基因组DNA基因重组转化细菌体外包装1)基因组文库(Genomiclibrary)是指将某种生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落，这个群体就称为该生物基因组文库。其目的是分离有用的目的基因和保存某种生物的全部基因。第十六页，共三十七页，2022年，8月28日2)cDNA文库(cDNAlibrary)：是指将某种生物体基因组转录的全部mRNA经反转录产生的cDNA片段分别与克隆载体重组，储存于某种受体菌中，该群体就称该生物基因组的cDNA文库。cDNA(complementaryDNA，互补DNA)：是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的mRNA经体外反转录后形成的互补DNA。第十七页，共三十七页，2022年，8月28日cDNA文库的构建：基因重组反转录酶mRNAcDNA第十八页，共三十七页，2022年，8月28日

根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使RNA序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测目的基因化学合成(二)人工方法合成目的基因第十九页，共三十七页，2022年，8月28日优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因专一性强操作过程麻烦，mRNA很不稳定，要求的技术条件较高专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因思考:

为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗?上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？第二十页，共三十七页，2022年，8月28日①概念：PCR全称为_______________，是一项在生物____复制___________的核酸合成技术②原理：__________④方式：以_____方式扩增，即____（n为扩增循环的次数）⑤结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增③条件：_______________________、

_______________、___________、___________.前提条件：

(三)利用PCR技术扩增目的基因聚合酶链式反应体外DNA复制已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸一对引物DNA聚合酶指数2n有一段以知目的基因的核苷酸序列特定DNA片段第二十一页，共三十七页，2022年，8月28日⑥过程：a、DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，_____断裂，形成___________b、退火（复性55℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。c、延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的________。氢键单链DNA双链DNA链第二十二页，共三十七页，2022年，8月28日(三)利用PCR技术扩增目的基因第二十三页，共三十七页，2022年，8月28日质粒DNA分子限制酶处理一个切口两个黏性末端两个切口获得目的基因DNA连接酶重组DNA分子（重组质粒）同一种二、基因表达载体的构建——核心第二十四页，共三十七页，2022年，8月28日基因表达载体的组成：复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因第二十五页，共三十七页，2022年，8月28日转化——方法将目的基因导入植物细胞将目的基因导入动物细胞将目的基因导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法——显微注射法——感受态细胞目的基因进入_________内，并且在受体细胞内维持_____和_____的过程受体细胞稳定表达三、将目的基因导入受体细胞第二十六页，共三十七页，2022年，8月28日三、将目的基因导入受体细胞第二十七页，共三十七页，2022年，8月28日——检查是否成功检测—个体生物学水平鉴定：①检测转基因生物染色体的DNA

上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交（注意与上不同之处）抗原-抗体杂交四、目的基因的检测与鉴定第二十八页，共三十七页，2022年，8月28日DNA分子杂交示意图

采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。P15思考与探究第二十九页，共三十七页，2022年，8月28日四、基因工程的成果及发展2、医药卫生：a、药品生产b、基因诊断与治疗我国生产的部分基因

工程疫苗和药物诊断原理：DNA分子杂交原理生产胰岛素第三十页，共三十七页，2022年，8月28日1、农牧业与食品工业生长快、肉质好的转基因鱼(中国)转黄瓜抗青枯病基因的甜椒转鱼抗寒基因的番茄第三十一页，共三十七页，2022年，8月28日3、环境保护

基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。通常一种细菌只能分解石油中的一种烃类，用基因工程培育成功的“超级细菌”却能分解石油中的多种烃类化合物。有的还能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT等毒害物质。第三十二页，共三十七页，2022年，8月28日例如：改造干扰素（半胱氨酸）体外很难保存干扰素（丝氨酸）体外可以保存半年玉米中赖氨酸含量比较低天冬氨酸激酶（352位的苏氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶（104位的天冬酰胺）改造改造天冬氨酸激酶（异亮氨酸）二氢吡啶二羧酸合成酶（异亮氨酸）玉米中赖氨酸含量可提高数倍第三十三页，共三十七页，2022年，8月28日蛋白质工程的概念

蛋白质工程：是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。前提：了解蛋白质的结构和功能原理：改造基因（基因修饰或基因合成）目的：定向改造或制造蛋白质第三十四页，共三十七页，2022年，8月28日基因表达流程图第三十五页，共三十七页，2022年，8月28日蛋白质工程流程图从预期的蛋白质功能出发设计预期的蛋白质结构推测应有的氨基酸序列找到相应的