核酸分子杂交专家讲座

1核酸分子杂交NucleicAcidHybridization核酸分子杂交专家讲座第1页21.

Basicprincipleofnucleicacidhybridization2.

Basicmethodofnucleicacidhybridization3.BiochipTechnology4.Preparation&labelofnucleicacidprobes5.

FactorsofnucleicacidhybridizationContents核酸分子杂交专家讲座第2页3核酸分子杂交技术发展史Hall等1961年工作开始，探针与靶序列在溶液中杂交，经过平衡密度梯度离心分离杂交体。Bolton等1962年设计了第一个简单固相杂交方法，称为DNA-琼脂技术。60年代末，Britten等研究液相中DNA复性以比较不一样起源核酸复杂度，用UV260nm吸光度来监测互补链复性程度。60年代中期Nygaard等将DNA或RNA探针固定在硝酸纤维素（NC）膜上。Brown等应用这一技术评定了爪蟾rRNA基因拷贝数。是当代膜杂交试验基础。固相化学技术和核酸自动合成仪诞生。70年代末期到80年代早期，分子克隆成为可能。能够从基因组DNA文库和cDNA文库中取得特定基因克隆，制备大量探针DNA。1975年英国爱丁堡大学Southern建立了Southern印记杂交技术，用于转化子分析。核酸分子杂交专家讲座第3页4TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1993.

"fortheirdiscoveriesofsplitgenes"

年上海交通大学微生物研究所核酸分子杂交专家讲座第4页5DNAmRNA法国科学家Chambon遗憾hybridizationelectronmicrographofOvalbuminmRNAandDNA核酸分子杂交专家讲座第5页6OvalbumingenehnRNAmodificationSplicingofhnRNAMaturemRNA核酸分子杂交专家讲座第6页7SectionIBasicprincipleofnucleicacidhybridization核酸分子杂交专家讲座第7页8denaturationrenaturation

核酸分子杂交是基于核酸分子变性和复性原理基础上产生和发展起来。核酸分子杂交专家讲座第8页9DNA变性是指在物理或化学原因作用下，DNA分子互补碱基对之间氢键断裂，使双链DNA分子变成两条单链DNA过程。I.Denaturation&renaturationofDNA核酸分子杂交专家讲座第9页101.FactorsthatcauseDNAdenaturation酸碱热变性剂（尿素酰胺）有机溶剂（乙醇丙酮）核酸分子杂交专家讲座第10页112.changesinphysicalandchemicalpropertiesofdenaturedDNA

Hyperchromiceffect粘度下降

浮力上升核酸分子杂交专家讲座第11页12λ（nm）A82℃OD260（A260）光密度（OD）亦称光吸收值（A）增色效应：DNA变性时，其溶液OD260增高。HyperchromiceffectistheincreaseofOD260ofamaterialthatoccurswhentheDNAduplexisdenatured.核酸分子杂交专家讲座第12页13OD260应用核酸浓度测定核酸纯度测定dsDNA：1OD260=50ug/mlssDNA/RNA：1OD260=40ug/ml寡核苷酸：1OD260=20ug/mlDNAOD260OD280=1.8~2.0>2.0RNA污染<1.8蛋白质、酚污染RNAOD260OD280=1.8~2.0>2.2降解为核苷酸<1.7蛋白质、酚污染核酸分子杂交专家讲座第13页14

Tm：双链DNA变性二分之一所需要温度称为解链温度或融解温度（meltingtemperature,Tm）。不一样DNA含有不一样Tm值，普通为85~90℃，其大小与G+C含量成正比。Tm=（G+C）%×0.41+69.3Thermaldenaturation核酸分子杂交专家讲座第14页15PCR热变性温度，普通为93~97℃。核酸分子杂交专家讲座第15页16

变性DNA在适当条件下，两条互补链可恢复天然双螺旋构象，这一现象称为复性。减色效应：

DNA复性时，其溶液OD260降低。3.RenaturationofDNAHypochromiceffectisthedecreaseofOD260ofamaterialthatoccurswhentheDNAisrenatured.核酸分子杂交专家讲座第16页17BasepairingofDNArenaturation核酸分子杂交专家讲座第17页18DNA浓度

DNA片段大小

DNA片段复杂性

适当复性温度

适当离子强度影响复性速度原因：核酸分子杂交专家讲座第18页19II.核酸分子杂交

不一样起源含有互补序列两条核酸单链在一定条件下按碱基配对标准形成双链过程。

DNA-DNA

DNA-RNA

RNA-RNA探针待测核酸分类核酸分子杂交专家讲座第19页20

DNA-DNA杂交双链分子变性复性

DNA-RNA杂交双链分子

RNA-RNA

杂交双链分子

寡核苷酸-DNA或RNA

杂交双链分子核酸分子杂交专家讲座第20页21核酸分子杂交技术基本原理

有互补特定核苷酸序列单链DNA或RNA混在一起时，其对应同源区段将会退火形成双链结构。如把一段已知基因（DNA或RNA）核酸序列用适当标识物（如放射性同位素、生物素等）给予标识，看成探针（probe),与变性后单链DNA或RNA进行杂交。再用适当方法（如放射自显影或免疫组织化学等技术）把标识物检测出来，就可确定靶核苷酸序列是否存在、拷贝数及表示丰度等。核酸分子杂交专家讲座第21页22

应用：(1)检测特定生物有机体之间是否存在亲缘关系；(2)用来揭示核酸片段中某一特定基因存在是否、拷贝数及表示丰度。核酸分子杂交专家讲座第22页23第二节核酸分子杂交

基本方法核酸分子杂交专家讲座第23页24

液相杂交固相杂交原位杂交Southernblot（检测DNA）Northernblot（检测RNA）斑点杂交/狭缝杂交核酸分子杂交专家讲座第24页25三种印迹技术比较SouthernblotNorthernblotWesternblot核酸分子杂交专家讲座第25页26

是指将电泳分离、原位变性单链DNA片段转移到固相支持物上，然后，与核酸探针杂交，检测DNA方法。一、Southern

Blot核酸分子杂交专家讲座第26页27带有DNA片段凝胶DNA分子限制片段限制性酶切割琼脂糖电泳转膜杂交、显影凝胶滤膜（尼龙膜/硝酸纤维素膜）吸附有DNA片段膜Southern印迹杂交技术流程胶内变性核酸分子杂交专家讲座第27页28基本步骤DNA制备、酶切电泳分离原位DNA变性DNA转膜预杂交、杂交、洗脱杂交结果检测（二）待测DNA样品电泳分离（三）凝胶中核酸变性（四）Southern转膜（一）待测核酸样品制备（五）Southern杂交（六）杂交结果检测核酸分子杂交专家讲座第28页29细胞组织化学试剂裂解细胞匀浆器研磨破碎组织中细胞蛋白酶、RNA酶消化大部分蛋白质和RNA酚/氯仿除去残余蛋白质DNA（100kb±）乙醇（一）待测核酸样品制备核酸分子杂交专家讲座第29页30

部分消化

充分消化限制酶消化EEEEEEHHDNA片段：（最长DNA片段控制在大约2kb）核酸分子杂交专家讲座第30页311000500250100750121：DNAmarker2：试验组（EcoRI）0.8~1％非变性琼脂糖凝胶（二）待测DNA样品电泳分离核酸分子杂交专家讲座第31页32碱变性：DNA原位变性，形成单链分子，方便进行分子杂交。酸中和：凝胶pH值恢复中性，方便DNA片段转移。（三）凝胶中核酸变性核酸分子杂交专家讲座第32页33

（四）Southern转膜及固定（250-500g）毛细管虹吸印迹法毛细转移真空转移电转移核酸分子杂交专家讲座第33页34核酸分子杂交专家讲座第34页35核酸分子杂交专家讲座第35页36转移后，各个DNA片段在膜上相对位置与在凝胶中相对位置依然一样，因而称为印迹（blot）。琼脂糖凝胶硝酸纤维素膜印迹（blot）注意：做好点样方向标识核酸分子杂交专家讲座第36页37预杂交：目标是将膜上全部能与DNA结合位点全部封闭，降低本底，使背景清楚洁净。甲酰胺20×SSCDenhardt氏溶液鲑精DNASDS杂交：预杂交液+探针DNA（六）Southern杂交预杂交液（五）探针制备核酸分子杂交专家讲座第37页38洗膜：高低1×SSC:Na+浓度0.2mol/L2×SSC:Na+浓度0.4mol/L0.2×SSC:Na+浓度0.04mol/L0.1×SSC:Na+浓度0.02mol/LNa+浓度除去：未反应探针与滤膜疏松结合探针非特异性结合探针核酸分子杂交专家讲座第38页39

X-ray片杂交膜放射自显影（七）杂交结果检测非放射性杂化分子检测核酸分子杂交专家讲座第39页40DNA分子杂交应用:

可进行DNA片段定位和分子量测定

可用于基因酶切图谱分析、基因突变分析

可用于检出特异DNA片段

可用于基因文库和cDNA文库筛选核酸分子杂交专家讲座第40页41分子杂交试验流程①②③核酸分子杂交专家讲座第41页42

是指待测RNA样品经电泳分离后转移到固相支持物上，然后与标识核酸探针进行固-液相杂交，检测RNA（mRNA）方法。二、NorthernBlot样品是RNA。电泳前，不酶切。电泳前，样品变性。电泳过程中，样品保持变性状态。电泳后，样品不再变性，直接转膜。需要尤其注意预防RNA被降解。全部器皿都要进行处理，尽可能除尽RNA酶。核酸分子杂交专家讲座第42页43三、Westernblotting核酸分子杂交专家讲座第43页44

将RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再采取特定探针进行杂交，这种杂交方法称为斑点杂交（dotblotting）或狭缝杂交（slotblotting）。四、斑点及狭缝杂交核酸分子杂交专家讲座第44页45多孔过滤加样器加样板支撑板抽真空板接真空泵印迹为圆形，称为斑点印迹印迹为线状，称为狭缝印迹核酸分子杂交专家讲座第45页46正常对照组试验组1试验组2试验组3用于特定基因表示定性及定量研究用于基因突变分析核酸分子杂交专家讲座第46页47

标识探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其进行检测一个方法称原位杂交。五、原位杂交

（insituhybridization）

检测基因在细胞内表示与定位

检测染色体中特定基因位置等

可用于基因克隆筛选菌落原位杂交(裂菌)核酸分子杂交专家讲座第47页48基本步骤：原位杂交分为：组织、细胞固定预处理预杂交、杂交杂交结果检测细胞内原位杂交和组织切片原位杂交（10％甲醛等）（蛋白酶、SDS、TritonX-100）（核素和非核素标识探针）核酸分子杂交专家讲座第48页49菌落原位杂交核酸分子杂交专家讲座第49页50核酸分子杂交专家讲座第50页51HPVFISH荧光原位杂交(FluorescenceinsituHybridization)人类染色体端粒DNA荧光原位杂交照片核酸分子杂交专家讲座第51页52三种印迹技术比较SouthernblotNorthernblotWesternblot胶内变性上样前变性上样前变性变性胶预杂交-核酸分子杂交专家讲座第52页53第三节生物芯片技术核酸分子杂交专家讲座第53页54生物芯片

生物芯片（biochip）是近年来在生命科学领域中快速发展起来一项高新技术，主要是指经过微加工技术和微电子技术在固体芯片表面构建微型生物化学分析系统，以实现对细胞、蛋白质、DNA及其它生物组分准确、快速与大信息量检测。核酸分子杂交专家讲座第54页55DNA芯片

蛋白质芯片

其它芯片生物芯片包含：按用途分：-样品制备芯片

-生化反应芯片-检测芯片核酸分子杂交专家讲座第55页56是指将许多特定DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积支持物上，然后与待测荧光标识样品进行杂交，杂交后用荧光检测系统等对芯片进行扫描，经过计算机系统对每一位点荧光信号做出检测、比较和分析，从而快速得出定性和定量结果。该技术亦被称作DNA微阵列(DNAmicroarray)。一、基因芯片基因芯片(genechip)核酸分子杂交专家讲座第56页57基因芯片(genechip)

Cy3Cy5核酸分子杂交专家讲座第57页58许多特定DNA片段或cDNA片段作为探针Cy3Cy5核酸分子杂交专家讲座第58页59核酸分子杂交专家讲座第59页60芯片制作工艺流程图（光引导原位聚合技术）核酸分子杂交专家讲座第60页61生物芯片研究总流程图主要基因芯片生产厂商：Affymetrix企业Clontech企业Panomics企业核酸分子杂交专家讲座第61页62是将高度密集排列蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕捉样品中靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析一个技术。二、蛋白质芯片蛋白质分子间亲和反应蛋白质芯片(proteinchip)蛋白质芯片作用原理核酸分子杂交专家讲座第62页63蛋白质芯片(proteinchip)抗原芯片原理图核酸分子杂交专家讲座第63页64第四节探针制备与标识核酸分子杂交专家讲座第64页65核酸探针（probe）：

探针是指带有检测标识，能与被检测核苷酸片段互补一段已知核苷酸片段。cDNA探针基因组DNA探针寡核苷酸探针RNA探针探针种类：核酸分子杂交专家讲座第65页66一、合成寡核苷酸探针注意标准(1)长度（10-50bp);(2)G:C对含量40%-60%；(3)探针内防止互补；(4)防止同一碱基连续出现；(5)与非靶序列有70%以上同源性或连续8个以上碱基序列相同，最好不用。核酸分子杂交专家讲座第66页67(1)标识前后探针基本结构、化学性质相同;(2)特异性强、本底低、重复性好；(3)操作简单、节时；(4)安全、无环境污染。二、标识物1、

一个理想标识物应满足：核酸分子杂交专家讲座第67页682、标识物种类32P、35S、3H、125I等半抗原：生物素（biotin）、地高辛（Dig）荧光素：异硫氰酸荧光素（FITC）、罗丹明等酶：辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等化学发光探针：增强鲁米诺发光体系、吖啶类化合物发光体系和碱性磷酸酶催化1，2-二氧环己烷发光体系非核素标识物核素标识物核酸分子杂交专家讲座第68页69体内标记体外标记化学法酶法三、标识方法缺口平移法随机引物标识法PCR标识法末端标识法核酸分子杂交专家讲座第69页70利用标识物分子上活性基团与探针分子上基团（如磷酸基团）发生化学反应将标识物直接结合到探针分子上。化学法：多聚体乙撑亚胺聚苯醌酶（如HRP）交联多聚体乙撑亚胺酶DNA戊二醛交联核酸分子杂交专家讲座第70页71酶法：OH5'5'3'

32P-dATP

生物素-dUTPorNTP

地高辛-dUTPorNTP

荧光素-dNTP核酸分子杂交专家讲座第71页72DNaseI5'5'3'3'5'5'3'3