临床微生物学检验：实验2

临床微生物学检验

实验第二周实验内容第一天：生物化学鉴定葡萄糖、乳糖、VP、MR、硫化氢、Indol、枸椽酸盐、双糖铁

第二天：生物化学鉴定苯丙氨酸脱氨酶、尿素酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、DNA酶、硝酸盐还原、氧化发酵（O/F）

第三天：生物化学鉴定氧化酶、触酶、DNA酶试验结果观察目的要求1.掌握鉴别细菌常用生化反应的原理、结果判定及接种方法。2.熟悉鉴别细菌常用的复合生化培养基(KIA)的原理、结果判定和应用第一天实验内容试剂（微量生化管）：葡萄糖、乳糖、VP、MR、硫化氢、Indol、枸椽酸盐、KIA

以上各种生化微量管2支/人菌种：大肠埃希菌、肠沙门菌、阴沟肠杆菌、福氏Ⅰa志贺菌等其他：砂轮、接种针、酒精灯常用指示剂变色范围指示剂颜色改变感应pH范围酸→碱溴甲酚紫黄→紫5.2～6.8溴麝香草酚蓝黄→蓝6.0～7.6甲基红红→黄4.4～6.0中性红红→黄6.8～8.0酚红黄红6.8～8.4碳水化合物代谢试验1、糖(醇、苷)类发酵试验原理：细菌含发酵糖(苷、醇)类的酶不同，分解糖（苷、醇）能力不同，代谢产物不同，指示剂呈酸性或碱性反应。

指示剂为溴甲酚紫

结果：

产酸：分解糖(苷醇)产酸，培养基变黄色＋产酸产气：培养基变黄且出现气泡＋无变化：－原理：某些细菌在代谢过程中分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸可进一步被分解为乳酸、乙酸、甲酸等，而使培养基的pH值下降至4.5以下，故加入甲基红指示剂出现红色（阳性）。有些细菌分解葡萄糖产酸量少，或产生的酸进一步转化为其它物质如醇、酮、醛、气体和水，则培养基的酸碱度仍在pH6.2以上，故加入甲基红指示剂呈黄色（阴性）原理：细菌在葡萄糖代谢过程中生成丙酮酸，丙酮酸进一步脱羧后可产生乙酰甲基甲醇。乙酰甲基甲醇在碱性溶液中被空气中的氧氧化为二乙酰（丁二酮），进而与培养基内的蛋白胨的精氨酸所含的胍基发生反应，生成红色化合物，即VP反应阳性。

2、甲基红试验（MR）及VP试验

葡萄糖

丙酮酸乙酰甲基甲醇混合酸(甲、乙、乳酸、琥珀酸)

KOH+空气甲基红指示剂丁二烯醇二乙酰PH<4.4红色

α奈酚+肌酸(MR+)

红色化合物

(VP+)

培养基:葡萄糖蛋白胨水

VP试验

MR试验试剂：甲液：6%α-萘酚酒精溶液。乙液：40%KOH溶液、0.3%肌酐。结果判定：阳性:红色

阴性:黄色/棕色

（再35℃0.5～1小时后观察）甲基红试剂：

结果判定：加入甲基红试剂1滴,

阳性:红色阴性:黄色-

+MR结果与VP结果相反3、硫化氢试验原理：细菌分解含硫氨基酸(胱aa、半胱aa)生成H2S，遇醋酸铅Pb或Fe2+形成黑色PbS或FeS沉淀培养基：硫化氢培养基结果判定：培养基变黑

+

-原理：细菌分解培养基中的色氨酸，生成吲哚，吲哚可与试剂中的对二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚而呈红色结果：反应结束加试剂数滴，两液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性

-

+4、吲哚试验原理：以枸橼酸钠为唯一碳源，磷酸铵为唯一氮源，若细菌能利用这些盐作为碳源和氮源而生长，则利用枸橼酸钠产生碳酸盐，与利用铵盐产生的NH3反应，形成（NH4）2CO3，使培养基变碱，pH升高，指示剂溴麝香草酚蓝由草绿色变为深蓝色结果:

阳性:蓝色;

阴性:绿色5、枸橼酸盐利用试验

-

+培养基：枸橼酸盐培养基6.克氏双糖铁培养基(KliglerIronAgar,KIA)组成：无糖培养基+1份葡萄糖+10份乳糖+铁盐+酚红

营养底物底物底物指示剂②分解葡萄糖+乳糖产酸(乳糖多，产酸多）上下层均变黄原理：①只分解葡萄糖产酸（葡萄糖少，产酸量少）上层酸氧化，红色下层缺氧，不氧化，黄色③产生硫化氢+铁盐FeS黑色沉淀

应用：检测肠杆菌科细菌对乳糖、葡萄糖的分解和产H2S能力。未接种菌的KIA乳（－）葡（＋）H2S(-)乳（-）葡（+）H2S(+)乳（+）葡（产酸产气）H2S(-)克氏双糖铁试验结果示意图各种生化培养基接种的细菌葡萄糖：大肠埃希菌、沙门菌或志贺菌乳糖：大肠埃希菌、沙门菌或志贺菌硫化氢：大肠埃希菌或志贺菌、沙门菌VP试验：大肠埃希菌、阴沟肠杆菌甲基红MR试验：大肠埃希菌、阴沟肠杆菌吲哚试验：大肠埃希菌、沙门菌或志贺菌枸椽酸盐：大肠埃希菌或志贺菌或沙门菌、阴沟肠杆菌KIA：大肠埃希菌、沙门菌或志贺菌每种生化试验每人均做！每个生化反应微量管分别接种两种不同的细菌！课后作业复习今天接种细菌的各种生化反应原理与结果预习第二天的各种生化反应原理及结果观察第二天实验内容试剂：苯丙、尿素、（赖氨酸、鸟氨酸、氨对）、DNA酶、硝还、O/F

以上各种生化微量管2支/人

O/F管4支/人菌种：大肠、变形、沙门、志贺、金葡、铜绿其他：砂轮、接种针、酒精灯观察昨天的生化反应结果并记录-

+MR和VP加试剂后观察+无色红色VP试验甲基红试验+-紫红色橘黄色加试剂后观察乳（+）葡（产酸产气）H2S(-)大肠埃希菌在KIA中结果乳（-）葡（+）H2S(+)伤寒沙门菌在KIA中结果乳（－）葡（＋）H2S(-)志贺菌在KIA中生长结果KA-+KA-+KA--AA+-原理：若细菌具有苯丙氨酸脱氨酶，能将培养基中的苯丙氨酸脱氨变成苯丙酮酸，苯丙酮酸能使三氯化铁指示剂变为绿色加入苯丙氨酸脱氨酶试剂:10%FeCl3阳性:培养基与试剂接触处出现绿色阴性:不变色培养基：苯丙氨酸培养基AB

+-1、苯丙氨酸脱氨酶试验

原理：细菌具有的尿素酶分解尿素产生氨(氨在溶液中形成碳酸铵)，培养基pH↑

培养基：尿素培养基

指示剂：酚红

结果：培养基呈碱性指示剂显红色+－

＋

AB2、尿素酶试验原理：不同细菌对不同的糖分解能力及代谢产物不同，这种能力因是否有氧气的存在而异，有氧条件下能分解称为氧化型，无氧条件下能分解称为发酵型,两种情况下均不分解的为产碱型。结果判定:仅在没有覆盖石蜡油的一管分解糖产酸或产酸产气者属氧化型；两管均分解糖产酸或产酸产气者为发酵型；两管都不生长者为产碱型。指示剂：溴麝香草酚蓝或溴甲酚紫培养基：Hugh-Leifson培养基3、氧化－发酵试验（OF）氧化－发酵试验（OF）发酵型ABC氧化型

产碱型4、氨基酸脱羧酶试验脱羧酶分解氨基酸使脱羧生成胺、CO2，培养基变碱性。

-coo赖氨酸尸胺

-coo鸟氨酸腐胺培养基：赖、鸟氨基酸脱羧酶及氨基酸对照培养基结果：对照管黄色测定管紫色+

接种细菌后，在培养基中加入石蜡油！原理：细菌如果能使硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐与试剂中的对氨基苯磺酸生成对偶氮苯磺酸，对偶氮苯磺酸再与试剂中的α-萘胺反应，生成可见的红色N-α-萘胺偶氮苯磺酸。硝酸盐还原的过程可因细菌的不同而异，①有的细菌可使其还原为亚硝酸盐和离子态的铵；②有的细菌使硝酸盐还原为亚硝酸盐后，进一步将亚硝酸盐分解成为氮，此时加入硝酸盐还原试剂不显色，但可以在培养基的小倒管中出现气泡，如假单胞菌等。硝酸盐或亚硝酸盐如果被还原成气体的终未产物如氮或氧化氮，就称为脱硝化或脱氮化作用。

5、硝酸盐还原试验甲液：甲基α-萘胺乙液：对氨基苯磺酸培养后加试剂：甲液、乙液各一滴阳性:红色阴性:无色在无色的培养基中再加入锌粉，判定结果硝酸盐还原试验硝酸盐还原试验ABAB-/+

+加锌粉+-加试剂后

DNA酶

原理：长链DNA寡核苷酸链

（可被酸沉淀）（可溶于酸）

方法：点种

-+6、DNA酶试验实验内容：各种培养基接种细菌苯丙：大肠埃希菌、变形杆菌尿素：大肠埃希菌、变形杆菌赖氨酸：伤寒沙门菌、奇异变形杆菌鸟氨酸：伤寒沙门菌、奇异变形杆菌对照管：分别接种伤寒沙门菌或奇异变形杆菌DNA酶：金葡菌、大肠埃希菌或铜绿假单胞菌硝还：大肠埃希菌或变形杆菌、铜绿假单胞菌O/F：大肠埃希菌、铜绿假单胞菌每种生化反应每个同学均做并分别接种两种细菌！！第三天实验内容试剂：氧化酶、触酶、1%盐酸菌种：大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肠球菌其他：砂轮、接种针、酒精灯观察昨天的生化反应结果OF试验发酵型氧化型＋－加入试剂后观察苯丙氨酸脱胺酶试验尿素酶试验－＋硝酸盐还原试验

－＋在无色的培养基中再加入锌粉红色（－）不产氮气无色（＋）产氮气氨基酸脱羧酶＋－＋－颜色与对照管一致的为阴性，颜色不同的则为阳性

－＋DNA酶试验结果加1%盐酸1、氧化酶试验

原理：

盐酸二甲基对苯二胺（无色）紫红色的醌类化合物

OR

盐酸四甲基对苯二胺（无色）蓝色的醌类化合物

方法：直接法、间接法（滤纸法、试剂纸片法）

结果：在10秒内呈紫红色－－阳性

注意事项：不宜用生锈的接种针或接种环

不宜用热的镊子